臨床治療新技術：光遺傳學不斷制造驚喜
?光遺傳學。來源：Mike Cohea, Brown University
編者按：
光遺傳學從基礎研究到臨床應用不過短短十幾年，在人類探索科學的漫漫長途中，這只是短暫的一瞬，但其從基礎到臨床的轉化過程卻非常迅速。在臨床醫(yī)學方面，光學調控已經顯出其獨特的優(yōu)勢：光對自然組織沒有損傷，卻可以根據(jù)遺傳工程的設計，選擇性地對神經細胞活動進行激活或調控。這為治療多種神經、精神疾病帶來曙光。雖然目前光遺傳學還在早期臨床試驗階段，其潛力卻令很多領域的科學家興奮不已。
撰文 | 周亮（赫爾辛基大學博士后）
責編 | 葉水送
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光遺傳學（Optogenetics）從基礎研究到臨床應用的飛速發(fā)展打破了人們對技術發(fā)展曲線的常規(guī)觀念。從基礎到臨床，光遺傳學都顯示出了無窮的活力和潛力，眾多新技術、新設備和新想法不斷涌現(xiàn)。
用光來控制神經細胞并不是本世紀全新的想法。早在1979年，DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一、諾貝爾獎獲得者弗朗西斯·克里克（Francis Crick）在《科學美國人》的一篇文章里就曾暢想，神經科學的發(fā)展需要一種新的工具，這種工具可以激活或者關閉特定的神經細胞，同時不影響其他的神經細胞。在這之后，他甚至還想出了一種特異性的控制方法：讓細胞具有光敏感性[1]。當然，在當時的理論和實驗基礎下，科學家們還不足以實現(xiàn)這樣的構想。
實際上利用光控制神經系統(tǒng)的想法，很多科學家一直在做，并開發(fā)出各種實用的工具。其中一種是把對光敏化學物質溶在神經組織周圍的體液里，當光線照射時化學物質就會釋放神經活性物質，這樣就可以用光照的時間、亮度和照射位置來定時、定量、定位，控制神經線路，并由釋放出的神經活性物質的性質，來確定控制的結果是興奮還是抑制。
?光遺傳學以及離子通道原理簡圖。來源：Brown University
從上個世紀中期開始，微電極逐漸成為神經科學研究的重要工具，它可以定點探測神經電信號和激活神經細胞。微電極是一種尖尖的針狀電極，尖端的直徑在0.1-100微米范圍，可以用于記錄或影響電極周圍小范圍的神經細胞：在記錄時，它就像一只采訪麥克風，只采集面前那個神經細胞的電信號，而不顧周圍喧鬧的環(huán)境；而在刺激時，微電極像個導播用的耳機，只把信號傳給與它接近的神經細胞。利用微電極技術就可以直接用電激活一個或一小群神經細胞。通過激活神經細胞，可以推測這些神經細胞或者神經回路的功能。
微電極技術在1950-2000年期間，成為最精確的神經細胞操縱方式，然而卻遠非理想，主要因為以下兩個問題：首先神經細胞有興奮和抑制兩類，就像汽車的油門和剎車。在腦組織中，這兩類神經細胞混合在一起，在給予電刺激的時候可能興奮抑制兩種細胞都被激活，就像油門剎車一起踩，效果不清楚。因此當對一小群神經細胞進行刺激后，會觀察到一些改變，但這些結果是哪一個或哪些神經細胞產生的，卻不清楚；
第二個問題是，在任何一個大腦的功能電路中有上億個神經細胞，用微電極激活的一個神經細胞或一小群神經細胞，所起的作用有限。當然人們可以加大電刺激以激活更多的神經細胞，但這必然也會帶來靶點以外細胞的激活，產生更復雜甚至難以預料的結果。以上兩個問題綜合起來，就像在研究機器原理的時侯，只有錘子一樣，砸的力量小時沒任何作用，力量大可能產生相互抵制的作用（就像油門剎車一齊踩）；如果力量再大些，機器則不工作了，說不清到底是因為哪部分被破壞產生的效應。
因此，人們需要一種可以特異性地調控一批神經細胞的工具和方法，就像鉗子改錐和扳子，可以用來特異地拆解某些零件。然而神經細胞很小，用于神經細胞的工具就要比鉗子改錐和扳子更先進，要求能在顯微尺度上自己到達需要研究的部位。遺傳工程學手段可以滿足這些苛刻的要求，把光敏蛋白裝置到需要研究的細胞上，而利用光來控制光敏感蛋白分子，就能實現(xiàn)定時定量和定點控制的要求。光遺傳學就是這么一門巧上加巧的技術。
下面我們來拆解光遺傳學的兩個關鍵技術。一是遺傳工程：每個細胞都帶著一份DNA藍圖，在生命的每一時刻，當細胞需要一些零件時，藍圖的一部分就被抄下，用于制造零件。遺傳工程就是修改DNA藍圖的技術。如果你能篡改DNA藍圖，把一個對光敏感的蛋白分子設計圖加進去，那么當這個設計圖被細胞抄寫，并執(zhí)行時，就會自動造出對光敏感的蛋白分子，這樣用光就可以直接控制細胞的活動。那么怎樣篡改DNA藍圖呢？方法有很多，最傳統(tǒng)的辦法就是利用病毒。在生命進化過程中，病毒早已發(fā)明出DNA篡改術，可把宿主細胞的DNA切斷，插進一段代碼，這就類似用你的計算機（細胞）跑我的程序（病毒代碼）。當然我們會事先拆解病毒，把有害的代碼去掉，添上制造光敏蛋白的代碼，當病毒感染神經細胞后，就會自動制造光敏蛋白了。除了病毒，科學家還在不斷地開發(fā)更精確更高效的技術。比如，兩位最近兩位在基因編輯領域非?；鸬目茖W家——MIT的張鋒和河北科技大學的韓春雨，分別開發(fā)了CRISPR和NgAgo技術，為切割DNA的精準刀鋒帶來了場及時春雨。（請參見《韓春雨：“一鳴驚人”的中國科學家發(fā)明世界一流新技術》一文）
第二個核心技術是光敏蛋白。這個也是純天然有機物質。生物進化出了眼睛，從此世間有了陽光。光敏蛋白實際上是可以用光開關的離子通道。神經系統(tǒng)可以被看做是一個高度復雜的電路系統(tǒng)。其中每個神經細胞都像個小電池一樣，靜靜地儲蓄電能，然后利用電能處理及傳輸信號。蓄電的過程需要依靠細胞膜上鑲嵌的幾種蛋白分子，如“泵”和離子通道來進行。通過控制離子跨細胞膜的流量，來控制電荷的積累，產生靜息態(tài)下的膜負電位。在靜息時遇到神經遞質等激活信號時，正離子通過通道蛋白進入細胞，導致細胞膜去極化；到達一定閾值時，將觸發(fā)動作電位，鈉離子快速內流，逆轉細胞膜的電壓，并沿著細胞膜、順著軸突產生連鎖反應，最終帶來神經遞質的釋放，激活或抑制相鄰的神經細胞。因此，電信號被用來傳輸神經信號和運算的介導。如果用光可以打開離子通道，就會讓細胞外的正離子洶涌流入，改變了靜息電位并引起動作電位。這樣，光子雖小卻可以四兩撥千斤，激活神經細胞。（對“泵”、離子通道、靜息和動作電位的介紹參見“知識分子”的前文《從磁場感受器說起:生物感受器的“四兩撥千斤”》）。
當微生物的光敏離子通道（channelrhodopsin）ChR1和ChR2蛋白被發(fā)現(xiàn)之后，一些敏銳的神經科學家馬上意識到，如果可以將這種通道蛋白用遺傳工程的方法，轉到神經細胞里，那么就可能通過光照來改變神經細胞的活性。
2005年，斯坦福大學的卡爾·德塞羅斯（Karl Deisseroth）和愛德華·博伊登（Edward Boyden）等人第一次將ChR2蛋白表達在了哺乳動物的神經細胞內，并發(fā)現(xiàn)藍光可以準確地控制神經細胞的活動[2]。
此后，細菌視紫質（Bacteriorhodopsin）與鹽細菌視紫紅質（Halorhodopsin）都被順利地表達于神經細胞中[3,4]。鹽細菌視紫紅質是一種副離子通道，當被光打開時大量氯離子涌入細胞，會降低靜息電位，產生抑制作用。這樣，人們可以通過不同的光來激活或抑制特定的神經細胞。隨著光遺傳學社區(qū)的無私分享與廣泛合作，構建于光遺傳學之上的材料和方法層出不窮，光遺傳學技術迅速席卷整個神經科學領域。
光遺傳學還是一項年輕的技術，談臨床應用似乎顯得太早。但其實從誕生不久起，神經科學界對光遺傳學應用于臨床的探索就沒有停止過。
例如2006年，美國韋恩州立大學華人科學家潘卓華教授（Zhuo-Hua Pan）實驗室，將ChR2蛋白表達于感光細胞退化的小鼠視網膜神經節(jié)細胞內，使其獲得了編碼光信號的能力[5]。雖然這項研究并沒有像德塞羅斯等人的研究那樣給神經科學界帶來重大革新，但其在光遺傳學初始階段就應用于治療疾病，領先于他人。
作為一名視覺研究專家，潘卓華意識到眼睛可能是光遺傳學最容易應用的區(qū)域，因為眼睛不僅是感光器官，對光的反應敏感，基因療法在眼睛上比較容易操作，因為眼球直接暴露在體表。而且作為中樞神經系統(tǒng)的一部分，眼睛有一定的免疫豁免特性。同時也不需要能發(fā)出光線的額外硬件，因為眼睛就是暴露在光下的。隨后，RetroSense Therapeutics公司與潘教授合作探索使用光遺傳學臨床治療失明，并于2015年成功拿到了美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）的臨床試驗批準，可在視網膜色素變性的患者身上，測試基于光遺傳學的治療方法。
?視網膜色素變性（Retinitis Pigmentosa）。來源：gallery4share.com
視網膜色素變性（Retinitis Pigmentosa）是一種遺傳性視網膜感光細胞退化疾病，與大約50多種基因突變有關，目前在全球約有150多萬名患者。這些患者的視網膜上負責夜晚視覺的視桿感光細胞先死亡，負責白天視覺的視錐細胞隨后死亡，使他們漸漸失去視覺。
目前，對于視網膜色素變性還沒有有效的藥物或手段進行康復性治療，延緩感光細胞死亡進程治療方法倒是有幾種：第一種方法是將單克隆抗體Ranibizumab注射到眼睛里，每兩周注射一次。它可以抑制血管內皮生長因子（VEGF），具備一定光感受器保護作用，但并不十分有效，第二種是針對基因RPE65突變造成視網膜色素變性的患者，Spark Therapeutics公司進行的基因療法臨床試驗顯示出不錯的效果，但可治療的人群范圍太窄，而且對已經完全失明的人來說沒有用。第三種方法是用仿生眼替換眼睛，目前的仿生眼技術還遠遠談不上成熟，既昂貴又麻煩，還不美觀，恢復的視力也非常弱。
RetroSense公司的光遺傳學治療，將含有光敏感通道DNA的病毒載體注射進入眼睛玻璃體中央，視網膜的最內層細胞——神經節(jié)細胞可被病毒所感染。一旦病毒載體將光敏感通道DNA介導進入神經節(jié)細胞，且神經節(jié)細胞開始制造光敏蛋白，它們就會在光線作用下被激活，也就是說，重新對外界光線起反應。RetroSense公司希望在視網膜上可以造出超過10萬的光敏感細胞，使患者至少能看到桌子和椅子以及大一點的字母，而目前的仿真眼只能讓患者一次獲得幾個像素的視覺信息。
2016年3月，RetroSense公司正式開始實施視網膜色素變性的光遺傳學臨床試驗RST-001項目，并成功完成了第一例病人的實驗，這也是世界上首例光遺傳學臨床治療。這項臨床研究共分為兩部分，第一部分的目標在于決定實驗所用試劑的濃度是否安全，患者是否耐受；第二部分將在最高劑量耐受組中獲取更多的安全性數(shù)據(jù)，為今后的臨床試驗設計提供數(shù)據(jù)支持。
光遺傳學有了第一例臨床試驗，接下來就會越來越多。除了視覺以外，還有許多其他神經系統(tǒng)疾病亟待治療。
2010年成立的初創(chuàng)公司Circuit Therapeutics就計劃將光遺傳學應用于神經疾病的治療中。第一步目標是慢性疼痛治療，以取代那些需要腦深部刺激的療法。因為受慢性疼痛影響的神經細胞就在脊髓外側，比腦深部的神經細胞更容易接近，在早期的動物實驗中，他們成功地將光敏感通道蛋白表達于痛覺相關的神經細胞中，并關閉了痛覺產生的通路。在注射含有光敏感通道蛋白DNA的病毒進入外周神經細胞的2周后，光敏通道蛋白就可以在其中穩(wěn)定地表達。這種光敏感通道蛋白與治療失明所用的蛋白不同，其效果剛好相反，用光照亮皮膚時，這種光敏感通道抑制了痛覺神經節(jié)細胞的活動，從而使痛覺感受和熱敏感性顯 著降低，而這兩個問題正是最讓慢性疼痛患者煎熬的問題。雖然人體試驗尚未進行，但可以預測其成功的可能性很高。
與之類似，不少機構也在嘗試用光遺傳學治療帕金森等更多的神經疾病。
?研究者通過小鼠的光遺傳實驗，研究如何降低人類的可卡因成癮。來源：Nat Neurosci, 2016
光遺傳學除了主導治療之外，還可以作為一種輔助手段。
最近，意大利的一項臨床試驗在光遺傳學的指導下，結合經顱磁刺激（Transcranial magnetic stimulation ，TMS）進行可卡因戒毒臨床治療[6]。由于之前有研究發(fā)現(xiàn)，“吸毒”大鼠的前邊緣皮層（Prelimbic Cortex）活性降低，通過光刺激光敏感通道，激活這個區(qū)域后，尋找毒品的行為減少。于是這個意大利的臨床試驗就在人身上進行了探索，把光遺傳學方法換成了更為無創(chuàng)的TMS。由于人腦的背外側前額葉皮層（Dorsolateral Prefrontal Cortex，DLPFC）執(zhí)行與大鼠前邊緣皮層類似的功能，而且定位于人腦表面，易于TMS刺激，結果也令人振奮：69%的癮君子，在TMS治療期間沒有復吸，而藥物治療的對照組這一比例只有19%。10個藥物治療組的患者，轉入TMS組后，藥物治療時原本有8個復吸，經過TMS治療后，只有3個復吸。單純的藥物治療和腦部刺激經常帶來脫靶效應（作用的靶點與期望的不一致），且精確度不高。與臨床更可行的治療方法相比，光遺傳學和神經回路機制指導的治療方案，會實現(xiàn)更好的效果[7]。
盡管光遺傳學進展十分迅速，但仍處于發(fā)展階段。在它的前十年中，相比神經細胞、突觸等領域劃時代的發(fā)現(xiàn)，光遺傳學還沒有為神經科學帶來根本性的突破。光遺傳學目前所做的事情只是讓神經回路更易操縱，明確某些神經細胞對某神經回路的意義，或者是探索細胞類型與特定回路之間的關系[8]。
在臨床應用中，光遺傳學同樣面臨不少問題。從理論基礎上看，我們對人腦細胞的類型只有很粗略的分類，這讓治療缺乏特異且明確的目標。對視網膜色素變性的治療之所以能成為第一個光遺傳學治療研究，這與我們對視網膜細胞類型的精確了解是分不開的。
從技術層面上說，光遺傳學也面臨兩個挑戰(zhàn)，一方面是光敏蛋白基因的導入，無論是轉基因還是病毒移植，如何有效地定位目標靶點，不觸發(fā)人體的生理反應，如免疫反應等，如何讓光敏蛋白基因在神經細胞中穩(wěn)定、持續(xù)地表達，保證其長期的安全性，這些都是需要注意的問題；另一方面，則是如何安置光源，與視網膜不同的是，大多數(shù)神經細胞都在大腦深部，光源難以到達，如何讓光源設備盡量小型化、可植入且易供電，是設備設計方面需要考慮的問題[9]。
隨著美國、歐洲以及日本腦計劃的實施，技術方面的難題正在逐步地解決。光遺傳學社區(qū)一直以來的共享精神和快速發(fā)展的傳統(tǒng)，相信會在短期內解決一系列光遺傳學應用于臨床的技術難題。未來會是怎樣，誰也無法預計，也許到時候很多人身上都有小開關，開關神經細胞就像開關燈那樣簡單。
參考文獻
1.Crick, Francis. "The impact of molecular biology on neuroscience." Philosophical Transactions of the Royal Society of London B: Biological Sciences 354.1392 (1999): 2021-2025.
2.Boyden, Edward S., et al. "Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity." Nature neuroscience 8.9 (2005): 1263-1268.
3.Chow, Brian Y., et al. "High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps." Nature 463.7277 (2010): 98-102.
4.Zhang, Feng, et al. "Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry." Nature 446.7136 (2007): 633-639.
5.Bi, Anding, et al. "Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration." Neuron 50.1 (2006): 23-33.
6.Terraneo, Alberto, et al. "Transcranial magnetic stimulation of dorsolateral prefrontal cortex reduces cocaine use: A pilot study." European Neuropsychopharmacology (2015).
7.Ferenczi, Emily, and Karl Deisseroth. "Illuminating next-generation brain therapies." Nature neuroscience (2016).
8.Boyden, Edward S. "Optogenetics and the future of neuroscience." Nature neuroscience 18.9 (2015): 1200-1201.
9.Deisseroth, Karl. "Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience." Nature neuroscience 18.9 (2015): 1213-1225.
