復(fù)旦大學(xué)最新研究揭示：舞蹈癥致病蛋白毒性可能從哪里來(lái)？
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撰文｜越君
責(zé)編｜李娟
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還記得幾年前火遍全球社交網(wǎng)絡(luò)的“冰桶挑戰(zhàn)”嗎？那次活動(dòng)讓人們了解到一種神經(jīng)病變，即“漸凍人癥”。與廣為人知的老年癡呆癥和帕金森病一樣，這類疾病都屬于神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative Disorders），是由于大腦和脊髓中的神經(jīng)細(xì)胞功能衰退所致。因?yàn)槿梭w的所有運(yùn)動(dòng)，包括說(shuō)話、吞咽以及呼吸肌的活動(dòng)等，都是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)細(xì)胞支配，一旦神經(jīng)細(xì)胞失去正常功能，帶來(lái)的就是這類足以讓人崩潰的疾病。
舞蹈癥的獨(dú)特之處
在神經(jīng)退行性疾病中，還有一種疾病格外引起科學(xué)家的注意——亨廷頓病（Huntingtin Disease），又稱舞蹈癥，因發(fā)病者肢體像跳舞般不受控運(yùn)動(dòng)而得名。亨廷頓病與其他同類疾病有個(gè)共同點(diǎn)，都是由致病蛋白質(zhì)在神經(jīng)細(xì)胞里的異常積累所引起。比如，亨廷頓病的致病蛋白是由變異HTT基因編碼的HTT蛋白。該疾病之所以讓很多科學(xué)家頗感興趣，還因?yàn)楹嗤㈩D病還有其獨(dú)特之處。
首先，亨廷頓病是遺傳病，單一基因HTT的突變就足以引發(fā)該病。這種單基因遺傳的性質(zhì)有利于對(duì)其致病機(jī)理的探索，基于此，科學(xué)家建立了相對(duì)可靠的疾病遺傳學(xué)模型，進(jìn)而嚴(yán)密地證明了HTT致病蛋白積累與該病的因果關(guān)聯(lián)。
其次，致病基因HTT的突變很特別。與單個(gè)核苷酸突變引起的遺傳病不同，HTT基因突變是一段三核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)改變。具體來(lái)說(shuō)，該基因有一段CAG重復(fù)序列，正常人中CAG的數(shù)目小于36個(gè)，而大于等于36個(gè)就會(huì)導(dǎo)致疾病。CAG序列編碼的氨基酸是谷氨酰胺(Glutamine)，簡(jiǎn)寫是Q，因此CAG重復(fù)序列對(duì)應(yīng)的氨基酸是QQQ…Q,常用polyQ來(lái)表示。亨廷頓病人的polyQ過(guò)長(zhǎng)，大多數(shù)病人有40多個(gè)重復(fù)，使得HTT蛋白成了導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡以及發(fā)病的“毒蛋白”[1]。
這里有一個(gè)非常重要又有趣的問(wèn)題，HTT蛋白本來(lái)不具有毒性，甚至是胚胎發(fā)育所必須的蛋白[2]，為什么該蛋白的polyQ長(zhǎng)度超過(guò)一定閾值就產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致如此嚴(yán)重的疾病呢？
毒性從哪里來(lái)
科學(xué)家提出了兩個(gè)模型嘗試對(duì)此問(wèn)題作出解釋。
第一個(gè)模型被稱為線性格柵模型（Linear Lattice Model）。科學(xué)家認(rèn)為，polyQ長(zhǎng)鏈好似鋪有整齊枕木的鐵軌，由相同的結(jié)構(gòu)單元組成，“枕木”之間的結(jié)構(gòu)單元可能本身就自帶毒性（intrinsictoxicity），polyQ越長(zhǎng)，蛋白的細(xì)胞毒性越強(qiáng)，達(dá)到一定程度就會(huì)造成疾病。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，即polyQ中具有線性排列的含有內(nèi)在毒性的結(jié)構(gòu)單元。
有哪些證據(jù)支持該模型呢？首先，體外生化實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，polyQ的抗體可以與很短的polyQ片段（10Q）結(jié)合[3,4]，而不同polyQ抗體與野生型短polyQ以及突變型長(zhǎng)polyQ的結(jié)合模式相同[3,4]。這提示polyQ長(zhǎng)鏈?zhǔn)怯上嗤慕Y(jié)構(gòu)單元組成。其次，有關(guān)蛋白功能的研究顯示，病人的發(fā)病年齡與polyQ長(zhǎng)度有關(guān)，polyQ越長(zhǎng)，病人的發(fā)病年齡總體來(lái)說(shuō)越早[1]。另有研究表明，如果把小鼠Htt基因的7個(gè)CAG重復(fù)完全刪除，小鼠不但沒(méi)有出現(xiàn)缺陷，反而延緩了衰老，變得更健康了[5]。
然而，該模型仍然很難解釋為何增長(zhǎng)的polyQ會(huì)突然產(chǎn)生嚴(yán)重毒性，較短的polyQ卻完全正常。而且，相關(guān)體外實(shí)驗(yàn)也無(wú)法反映細(xì)胞中的情況，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的polyQ可能具有多種不同構(gòu)象。
于是，有科學(xué)家提出了第二個(gè)可能的解釋——毒性浮現(xiàn)構(gòu)象模型（Emergent Conformation），即變異蛋白的polyQ長(zhǎng)度達(dá)到一定閾值之后，會(huì)出現(xiàn)與“整齊的枕木”不同的新的構(gòu)象單元，而這種新的構(gòu)象單元是導(dǎo)致神經(jīng)毒性的主要原因。這種解釋并沒(méi)有否定線性格柵模型，只是推測(cè)除了線性格柵構(gòu)象之外，polyQ長(zhǎng)鏈上還出現(xiàn)了真正具有毒性的“浮現(xiàn)構(gòu)象”，因此是多種構(gòu)象的混合（圖1，摘自參考文獻(xiàn)[6]）。
?圖1 解釋變異毒性蛋白HTT中polyQ長(zhǎng)鏈構(gòu)象的線性格柵模型（Linear lattice）與毒性構(gòu)象浮現(xiàn)模型(Emergent conformation)。[6]
毒性浮現(xiàn)模型的支持證據(jù)相對(duì)來(lái)說(shuō)非常間接，主要是基于不同polyQ抗體識(shí)別的變異HTT蛋白信號(hào)與細(xì)胞毒性的相關(guān)性不同，因此推測(cè)變異HTT蛋白過(guò)長(zhǎng)的polyQ具有多種構(gòu)象，其中包括了最具毒性的“浮現(xiàn)構(gòu)象”[6]。這里相關(guān)性的計(jì)算基于很多非直觀的假設(shè)，缺乏更直接的證據(jù)，被不少研究反對(duì)[4,7]。
由此可以看出，以上兩種觀點(diǎn)最大的爭(zhēng)議在于，變異蛋白中過(guò)長(zhǎng)的polyQ是否存在多種不同的構(gòu)象，也就是構(gòu)象是否存在“多態(tài)性”。
這可能是生物化學(xué)的一個(gè)根本問(wèn)題。因?yàn)槲覀冎?，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)由該蛋白質(zhì)的氨基酸序列所決定，這被稱為Anfinsen法則（Anfinsen’s Dogma），并獲得1972年的諾貝爾獎(jiǎng)。該法則也是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的基礎(chǔ)，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究基于這樣的假設(shè)：蛋白質(zhì)在特定體外條件下的三維結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)的三維結(jié)構(gòu)相同。
然而，有不少蛋白會(huì)“錯(cuò)誤折疊”（misfolding）并產(chǎn)生不同的構(gòu)象。在神經(jīng)退行性疾病中，“錯(cuò)誤折疊”的蛋白容易聚集在一起并最終形成蛋白沉淀。那么，可溶性蛋白質(zhì)的單體是否也會(huì)違背Anfinsen法則，通過(guò)“錯(cuò)誤折疊”產(chǎn)生多種不同的構(gòu)象，進(jìn)而產(chǎn)生不同的毒性，最終導(dǎo)致疾病呢？目前還沒(méi)有答案。而且，如果真的存在“多態(tài)性”，為什么其中某些構(gòu)象的毒性會(huì)更高？這也是關(guān)于疾病致病機(jī)制的根本性問(wèn)題。
但是研究上述問(wèn)題很難。變異HTT蛋白非常大（>300kDa），結(jié)構(gòu)難于解析。即使可以解析，目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段無(wú)法在細(xì)胞非變性條件下解析特定目標(biāo)蛋白的精細(xì)結(jié)構(gòu)，而體外純化的條件下則可能無(wú)法獲得蛋白折疊的各種構(gòu)象，更加無(wú)法進(jìn)一步證明各種構(gòu)象可能的功能（毒性）差異。
用“蛋白質(zhì)降解”來(lái)探尋答案
2017年9月4日，Nature Chemical Biology在線發(fā)表了一篇論文[8]，由復(fù)旦大學(xué)魯伯塤課題組完成，該論文從一個(gè)嶄新的角度研究上述問(wèn)題：蛋白質(zhì)降解。
細(xì)胞中，新蛋白質(zhì)在不斷地合成，完成功能的或者“錯(cuò)誤折疊”的蛋白質(zhì)則被不斷地降解，生成小的肽段或氨基酸。主要有兩個(gè)可能的因素影響蛋白降解速率：蛋白構(gòu)象和蛋白功能。
一方面，蛋白構(gòu)象很可能影響其降解速率，如果同類細(xì)胞的同一蛋白有著不同的降解速率，意味著該蛋白存在不同的構(gòu)象；另一方面，蛋白降解是蛋白功能的終極調(diào)控。已有數(shù)據(jù)表明，疾病蛋白的降解速率與其神經(jīng)毒性呈非常顯著的負(fù)相關(guān)，即致病蛋白降解越慢，其毒性越大[9]。因此，了解蛋白本身是否具有構(gòu)象的“多態(tài)性”，以及不同構(gòu)象蛋白的毒性是否具有“多態(tài)性”，都可以從研究蛋白的降解速率入手。如果不同polyQ抗體識(shí)別的HTT蛋白的降解速率不同，則證明的確存在不同構(gòu)象，而且降解速率較慢的構(gòu)象的毒性可能較大。
為了檢測(cè)以上假說(shuō)，魯伯塤課題組測(cè)得了同一組樣品中被不同polyQ抗體（主要有MW1和3B5H10兩種）所識(shí)別的HTT蛋白的降解速率。他們所使用的測(cè)量方法被稱為CH-chase，是基于點(diǎn)擊化學(xué)（Click Chemistry）和均相時(shí)間分辨熒光（HTRF）技術(shù)而建立的。
首先，他們選用的細(xì)胞模型是病人的真皮成纖維細(xì)胞，這是因?yàn)樵摷?xì)胞中有全長(zhǎng)的變異HTT蛋白，并且檢測(cè)不到寡聚體或多聚體，排除了可能的干擾因素，進(jìn)而只檢測(cè)可溶性HTT蛋白單體的降解。研究顯示，在三種不同的病人真皮成纖維細(xì)胞中，polyQ抗體3B5H10所識(shí)別的HTT的降解速率顯著低于另一種polyQ抗體（MW1）所識(shí)別的HTT的降解速率，從而直接證明了不同polyQ構(gòu)象的存在。這種降解速率差異在過(guò)表達(dá)的體系中一樣可以被檢測(cè)到。有趣的是，這種差異只在過(guò)長(zhǎng)的polyQ（46Q，72Q，100Q）中存在，在野生型長(zhǎng)度的polyQ（18Q及23Q）中并沒(méi)有檢測(cè)到，從而證明了過(guò)長(zhǎng)的polyQ出現(xiàn)了“浮現(xiàn)構(gòu)象”，因此產(chǎn)生了“多態(tài)性”。
那么，是什么因素減慢了這類HTT蛋白的降解速率呢？魯伯塤課題組的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致3B5H10抗體所識(shí)別的HTT蛋白的降解顯著變慢的原因，是因?yàn)槠淠軌虻挚棺允勺饔谩?/p>
自噬（Autophagy）是細(xì)胞清除蛋白的重要手段，自噬小泡包裹住蛋白，并將其運(yùn)送至溶酶體完成降解。自噬分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)獲得了2016年的諾貝爾獎(jiǎng)。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，自噬作用是非選擇性地，能隨機(jī)清除任何蛋白。然而近年研究發(fā)現(xiàn)，有些自噬過(guò)程中，自噬小泡會(huì)利用自噬受體蛋白p62或NBR1等有選擇性地吞噬特定的蛋白，這個(gè)過(guò)程稱為選擇性自噬。
魯伯塤課題組的研究發(fā)現(xiàn)，在病人細(xì)胞、小鼠大腦組織乃至病人大腦組織中，變異HTT蛋白的賴氨酸63型泛素化幾乎缺失，因此無(wú)法被選擇性自噬受體蛋白p62所識(shí)別，也就無(wú)法被選擇性自噬降解。這就解釋了為何這種HTT構(gòu)象降解速度顯著變慢（圖2）。
?圖2 亨廷頓致病蛋白HTT的polyQ長(zhǎng)鏈有多種構(gòu)象，其中具有毒性的構(gòu)象蛋白比野生型蛋白降解得要慢，因?yàn)樗鼰o(wú)法被自噬小泡包裹而進(jìn)行快速降解，這也可能是其產(chǎn)生更高神經(jīng)毒性的原因。
這項(xiàng)最新研究揭示了導(dǎo)致亨廷頓疾病的變異蛋白HTT的polyQ長(zhǎng)鏈存在多種不同的構(gòu)象，并因此導(dǎo)致了不同的降解速率，產(chǎn)生了不同的毒性。這種“多態(tài)性”可能補(bǔ)充了對(duì)“Anfinsen法則”的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，該研究進(jìn)一步明確了選擇性自噬作用的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)選擇性自噬比之前認(rèn)為的要更具選擇性：它不僅能識(shí)別特定的蛋白進(jìn)行降解，甚至能識(shí)別同一蛋白的不同構(gòu)象。
該研究在疾病研究領(lǐng)域也有重要意義，不僅刷新了科學(xué)家對(duì)疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且提供了治療疾病的新思路。例如，可尋找化合物迫使疾病蛋白從慢速降解的構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖俳到獾臉?gòu)象，達(dá)到治療疾病的目的。不過(guò)，仍然有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題亟待解答，比如，為何polyQ構(gòu)象的改變會(huì)影響HTT的泛素化以及選擇性自噬的識(shí)別，其他polyQ蛋白是否具有類似的性質(zhì)等，值得后續(xù)研究。
參考文獻(xiàn)
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9.Tsvetkov, A.S., et al., Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nat Chem Biol, 2013. 9(9): p. 586-92.
制版編輯： 許逸｜
