“諾獎值得”系列：蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶誕生記
弗朗茲-烏爾里希·哈特爾（左） 、亞瑟·霍里奇（右）
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因在蛋白質(zhì)折疊的分子機制上的貢獻，馬克斯·普朗克生化研究所主任、德國生物化學(xué)家弗朗茲-烏爾里?！す貭?/strong>（Franz-Ulrich Hartl，1957-）與耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的美國生物學(xué)家亞瑟·霍里奇（Arthur L. Horwich，1951-）幾乎已經(jīng)拿下了除諾獎外所有的生物化學(xué)及相關(guān)學(xué)科的國際大獎。
2011年，即屠呦呦獲得拉斯克獎（The Lasker Awards）臨床醫(yī)學(xué)獎的同一年，哈特爾和霍里奇也獲得了拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎。2020年，哈特爾和霍里奇又摘取另一諾獎風(fēng)向標——美國生命科學(xué)突破獎，是諾獎預(yù)測名單上的?？?。
蛋白質(zhì)的折疊機制是重要的生物學(xué)問題?！吨R分子》特別推出“諾獎值得”系列專欄，向讀者介紹那些重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)及其背后的故事。
Talent hits a target no one else can hit; genius hits a target no one else can see.
人才及凡人所不能及，天才及凡人所不能見。—— 叔本華
撰文 | 王宗安（芝加哥大學(xué)計算化學(xué)博士）
責(zé)編 | 劉楚
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哈特爾的兩大愛好
弗朗茲-烏爾里?！す貭柍錾?957年的西德工業(yè)城市埃森（Essen），四歲時隨父母搬遷到黑森林（Black Forest）北部的一個小鎮(zhèn)。在林野間，捉蛙捕螈，蹚溪筑壩，哈特爾度過了美好的童年。自五歲，哈特爾開始學(xué)習(xí)樂譜，先后學(xué)會了木笛、長笛和鋼琴，音樂成為了他保持終身的兩大愛好之一。另一個愛好嘛，是生物學(xué)！確切地說，哈特爾對生物學(xué)的興趣是捕捉、收集昆蟲，制作標本，用顯微鏡觀察?！耙肟印?的是他的爺爺，一位業(yè)余顯微鏡大拿。進入高中后，哈特爾找到了新的愛好：生物化學(xué)。[1]
19歲，哈特爾進入海德堡大學(xué)（Heidelberg University）醫(yī)學(xué)院學(xué)醫(yī)。在完成必要醫(yī)學(xué)訓(xùn)練的同時，哈特爾在生物化學(xué)系進修博士學(xué)位。期間，他發(fā)現(xiàn)肝細胞的一類細胞器過氧化物酶體（peroxisome），可以被甲狀腺激素代謝激活并誘發(fā)大量增殖 [2]。
1985年，哈特爾的博士論文被送給慕尼黑大學(xué)的著名細胞生物學(xué)家瓦爾特·諾佩特（Walter Neupert，1939 - 2019）[3]評審。諾佩特很賞識這篇論文，邀請哈特爾來自己的實驗室做博后研究—— 這成為了哈特爾人生至關(guān)重要的轉(zhuǎn)折。
對哈特爾而言，這個轉(zhuǎn)折有雙重意義。一方面，導(dǎo)師諾佩特在1986年將他派往希臘參加分子生物學(xué)暑期學(xué)習(xí)，令他結(jié)識了未來的生活愛侶和科學(xué)良助瑪納吉特（Manajit）；另一方面，在諾佩特實驗組研究線粒體吸收（import）新合成蛋白，催生了其分子伴侶的工作。
哈特爾與夫人瑪納吉特于2020年領(lǐng)取生命科學(xué)突破獎 | 照片版權(quán)：Miikka Skaffari
蛋白質(zhì)折疊的安芬森法則
我們先談?wù)劦鞍踪|(zhì)在細胞內(nèi)怎么折疊。
1972年的諾貝爾化學(xué)獎得主克里斯蒂安·伯默爾·安芬森（Christian Boehmer Anfinsen, 1916 – 1995）曾這樣猜想：小的水溶性蛋白質(zhì)在生理環(huán)境條件下的天然結(jié)構(gòu)僅取決于其氨基酸序列 [4]。這被稱為安芬森法則（Anfinsen’s dogma），也被稱為蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)猜想（thermodynamic hypothesis）。
安芬森法則是今日蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的計算預(yù)測的基石，說是公設(shè)也可以，是不容置疑的、需要提前承認的法則——在此公設(shè)框架下進行計算預(yù)測。
安芬森本人是基于對核糖核酸酶（ribonuclease A）的研究做出上述假說的。他觀察到，令純化的有生理活性的酶變性以至于其多肽長鏈打開（unfold），之后通過稀釋溶液降低變性劑濃度，已經(jīng)去折疊的蛋白會自發(fā)地重新獲得酶活性。這表明，酶自發(fā)地、正確地折疊回去了，即，酶的氨基酸序列足以特異性地決定其三維結(jié)構(gòu)以及酶活功能。
更明白地說，酶的折疊不需要其它蛋白質(zhì)的協(xié)助，也無需輸入額外的能量（如ATP）。
如此簡潔、明白、優(yōu)美的物理理解在當時并不容易被接受，甚至可謂石破天驚。多年后本文的另一位主人公——亞瑟·霍里奇回憶 [5]，“安芬森得諾獎時，自己與實驗室的組員連著討論了好多天，簡直讓人驚呆了，安芬森真膽大包天啊，怎么會期待讓變了性的蛋白再折疊回去、恢復(fù)功能？”
當然安芬森法則所描述的折疊發(fā)生于所謂 in vitro（體外）實驗條件下。在細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊，即 in vivo（體內(nèi)），即使基本法則不變，情況也復(fù)雜得多得多。
大家可以想象：一個接一個的氨基酸在蛋白質(zhì)的制造工廠 —— 核糖體內(nèi)被綴鏈到一起，生成一個新的蛋白；這個新蛋白，猶如一段擠出來的牙膏，離開核糖體，進入細胞質(zhì)（cytosol）。這個還沒有折疊的蛋白質(zhì)長鏈上的一些氨基酸殘基又油又黏，另一些則又潤又滑。油膩的殘基傾向于聚合而包埋到蛋白質(zhì)內(nèi)部，水潤的殘基傾向于暴露朝外，與外部水溶液接觸。
現(xiàn)在問題來了：細胞內(nèi)非常擁擠，充滿了各種折疊的、半折疊的、未折疊、甚至錯誤折疊的蛋白質(zhì)分子，如何能保證自己的折疊不受旁邊分子的干擾呢？
發(fā)現(xiàn)折疊酶
自60年代安芬森提出蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)假說，近30年間，基石般的法則左右了整個生物學(xué)界對待蛋白質(zhì)折疊問題的態(tài)度。哈特爾回憶 [5]，“細胞生物學(xué)家就是對蛋白質(zhì)折疊不感興趣，這是研究試管里蛋白質(zhì)自發(fā)反應(yīng)的生物物理學(xué)家和生物化學(xué)家的領(lǐng)域。”
直到80年代末，兩位年輕人的科研軌跡相互交叉。
年齡稍大的霍里奇結(jié)束兒醫(yī)住院醫(yī)師訓(xùn)練后回到耶魯大學(xué)，加入了醫(yī)學(xué)院院長里昂·羅森博格（Leon Emanuel Rosenberg，1933-）的課題組。仍然對蛋白折疊心心念念的霍里奇希望能挑一個兒科病，結(jié)合當時已有的DNA重組技術(shù)，從分子生物學(xué)角度闡明它的致病機理。他瞄上的是一種罕見的X染色體遺傳?。?/span>鳥胺酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶（ornithine transcarboxylase deficiency，OTC）缺乏癥。OTC是一種線粒體酶。遺傳有這種致命疾病的新生兒不能正常代謝尿素，血氨增高。
霍里奇研究發(fā)現(xiàn) OTC 在細胞溶膠內(nèi)合成，然而必須要進入線粒體，才能發(fā)揮功能。利用酵母作為載體篩查人體酶的基因突變，他發(fā)現(xiàn)一種特殊的酵母突變體能夠?qū)CT運輸入線粒體，但是OTC卻沒有酶活。那么這時可能有兩種情況：（1）OTC其實沒有真正進入線粒體；（2）OTC進入了線粒體，但沒有正確折疊，因而無法發(fā)揮催化功能。
話分兩頭。此時大西洋的另一邊，哈特爾剛剛開始研究蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的輸運，特別是蛋白質(zhì)如何進入線粒體。在研究過程中，哈特爾認識到，蛋白質(zhì)必須先打開，進入線粒體之后再重新折疊功能狀態(tài)?！?這可不巧了嘛，霍里奇和哈特爾的研究互補了！
蛋白質(zhì)進入線粒體示意圖[6]
1988年，哈特爾的導(dǎo)師諾佩特給霍里奇打了一個越洋電話。霍里奇幾乎放下電話就去買了飛往慕尼黑的機票。[5]
面對霍里奇帶來的結(jié)果，諾佩特和學(xué)生們盡管感到很興奮，卻依舊保持懷疑 —— 如果要證明存在一種輔助OTC折疊的蛋白質(zhì)，必須要證明 OTC 完全進入了線粒體，因為OTC可能在穿過線粒體膜的過程中“卡住”，而這種情況下呈打開狀態(tài)的OTC可能會被從中切斷而失去活性?！?這時，哈特爾主動請纓，自己來做這個實驗。
僅僅幾周，哈特爾就做出實驗結(jié)果—— OTC的確完全進入了線粒體。這意味著，線粒體內(nèi)確實存在一種折疊酶（foldase）。哈特爾、霍里奇以及諾佩特等人于1989年在 《自然》上發(fā)表了兩篇標志性論文 [7-8]：安芬森法則統(tǒng)治蛋白質(zhì)折疊的時代結(jié)束了。
哈特爾在32歲用了幾個星期做出了讓他在日后蜚聲科學(xué)界的工作。
文獻 [7] 證明一種名為hsp60的線粒體內(nèi)的熱休克蛋白在進入線粒體的蛋白的組裝過程中起關(guān)鍵作用。因為 hsp60 符合約翰·埃利斯（John Ellis）在1987年對 “分子伴侶”（molecular chaperone）的定義，所以被歸納為一種分子伴侶蛋白。[9] 這篇論文的首作者鄭明媛（CHENG Ming Y.，右上角）是霍里奇的最早的研究生之一， 現(xiàn)已從臺灣省國立陽明大學(xué)生命科學(xué)系暨基因體科學(xué)研究所退休?；衾锲嫘稳菟秊?/span> “無所畏懼的實驗學(xué)家”。[10-11]
文獻 [8] 則進一步證明線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)折疊必須要hsp60，并且消耗ATP水解的能量。
分子伴侶：熱休克蛋白
哈特爾和霍里奇一同榮獲過許多獎項，包括2011年的拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究獎。荷蘭遺傳學(xué)細胞生物學(xué)家、洛克菲勒大學(xué)教授蒂蒂亞·德朗厄（Titia de Lange）是二人獲得拉斯克獎的現(xiàn)場介紹人。
德朗厄在介紹二人獲獎工作時做了一段很精妙的比喻，來說明熱休克蛋白hsp60的功能：
“Hsp60體系像一座監(jiān)獄能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)囚禁在單人牢房—— 這就像是美國的監(jiān)禁制度（American penal system），只是去掉了無人道的（inhumane）部分，并且更加高效。Hsp60形如圓桶，抓住去折疊蛋白分子的黏性部分，將之拽入桶內(nèi)，并關(guān)閉桶蓋。此時陷入hsp60的蛋白分子嘗試各種姿態(tài)構(gòu)象進行折疊，而不必碰撞其它蛋白質(zhì)分子。Hsp60的桶壁高度帶電。蛋白質(zhì)分子被關(guān)押在桶內(nèi)約10秒，可以想象，它在此過程中掙扎、扭動，碰撞墻壁，直至桶門打開。越獄犯可能完成了正確折疊，成為了細胞內(nèi)茫茫蛋白中的一位好好公民，也可能還沒有完成折疊。那么這樣的累犯會迅速被捕獲、押解入另一個囚籠。這個先擒后縱的過程可能往復(fù)十次，才最終令一條多肽鏈正確折疊，進而獲得保釋，允許出獄，如同一個模范公民，去履行自身的職責(zé)，再也不與其它蛋白質(zhì)分子有非分接觸?！?/span>
“哈特爾和霍里奇的工作大大加深了我們對細胞生命功能的理解，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)方面有廣泛應(yīng)用。幾乎所有蛋白質(zhì)在其熟化（maturation）過程中都需要分子伴侶的某種形式的參與，而幾乎所有生命體都使用 “單獨囚禁” 的方式驅(qū)策它們的一部分蛋白正確折疊。分子伴侶-輔助的蛋白質(zhì)折疊給我們提供許多洞見，以理解因蛋白變異而導(dǎo)致的疾病，如阿爾茨海默癥、帕金森癥、盧·賈里格癥（又稱肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、漸凍癥）等。” [6]
Hsp60-Hsp10 分子伴侶復(fù)合體功能示意圖[12]
哈特爾的學(xué)術(shù)家譜
筆者敘述科學(xué)家事跡有一個習(xí)慣：總免不了考察他的學(xué)術(shù)家譜。哈特爾是德國培養(yǎng)的科學(xué)家，在當前美國的生命科學(xué)整體領(lǐng)先歐洲及東亞的大背景下，追索一下他的師承脈絡(luò)，可能會給我們帶來一些有益的啟發(fā)。
哈特爾的學(xué)術(shù)生涯里先后有三位導(dǎo)師：博士導(dǎo)師、化學(xué)家、海德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授 Hans Schimassek，博后導(dǎo)師、細胞生物學(xué)家、慕尼黑大學(xué)教授瓦爾特·諾佩特，博后導(dǎo)師、生物化學(xué)家、達特茅斯學(xué)院教授威廉姆·維克納（William T. Wickner）[12]。
哈特爾曾自述在諾佩特教授處的經(jīng)歷是其人生重大轉(zhuǎn)折，那么我們重點攀著諾佩特的師承譜系樹上行看一看。
筆者根據(jù) academictree.org、維基百科、nobelprize.org 等網(wǎng)站整理，自最左諾佩特向右顯示了學(xué)術(shù)代際繼承關(guān)系，黑色箭頭附近的紅色字體表明導(dǎo)師與學(xué)生的具體關(guān)系以及前者指導(dǎo)后者的時間。每位科學(xué)家所屬的主要領(lǐng)域?qū)懺谄渖淠晗路?。特別地，我用藍色字體標出學(xué)生在導(dǎo)師處的主要研究方向；例如，諾佩特在其博士導(dǎo)師西奧多·布夏（Theodor Bücher）處的主要工作是研究線粒體的形成與形態(tài)。[13]
這張圖展現(xiàn)的7位科學(xué)家中，有幾位的名字格外響亮。
奧托·海因里?！ね郀柋?/span>（Otto Heinrich Warburg）因為其對呼吸酶的發(fā)現(xiàn)和研究而榮獲1931年諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎。
赫爾曼·埃米爾·費歇爾（Hermann Emil Fischer）因為其對嘌呤和糖類的合成而榮獲1902年諾貝爾化學(xué)獎，但他更出名的是以其名字命名的費歇爾投影式（Fischer projection），本科有機化學(xué)課必講內(nèi)容。
奧古斯特·凱庫勒（August Kekulé）可能更著名一些，畢竟苯環(huán)的凱庫勒式（Kekulé structure）進入的是高中課本，甚至他的夢（Kekulé's dream）—— 因為夢見頭尾相銜的蛇（ouroboros）而想出了苦苦思索的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，都進入了高中教材。
阿道夫·馮·拜爾（Adolf von Baeyer）因為合成靛藍（indigo）而榮獲1905年諾貝爾化學(xué)獎，落后于他的博士生費歇爾，沒辦法學(xué)生太優(yōu)秀了；他還發(fā)現(xiàn)了酚酞，進入了初中教材。
我們可以看到，費歇爾→瓦爾堡→布夏→諾佩特→哈特爾，他們的研究一脈相承，漸次推進，非常連貫。瓦爾堡在博士期間細致地研究多肽分子在與呼吸有關(guān)的氧化反應(yīng)中發(fā)揮的作用和代謝機理，并且由于自己的醫(yī)學(xué)背景，使得布夏在博士期間致力于理解血紅蛋白的氧化還原反應(yīng)；進而，當諾佩特開始讀博，研究細胞呼吸作用的線粒體如何形成、如何功能則成為當時細胞生物學(xué)的研究焦點；接著，哈特爾恰逢其會地由對線粒體輸運蛋白的研究發(fā)現(xiàn)分子伴侶。順理成章。
制版編輯 | 盧卡斯
