藍(lán)綠細(xì)菌的生物鐘，“另類”還是“先驅(qū)”？| 迷上生物鐘（2）
?藍(lán)綠細(xì)菌（或稱為藍(lán)藻）細(xì)胞
撰文 | 秦曦明 （安徽大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)生物節(jié)律分會(huì)委員）
責(zé)編 | 徐 可
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瑞典皇家科學(xué)院宣布將2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予杰弗里·霍爾(Jeffrey C. Hall)、邁克爾·羅斯巴什(Michael Rosbash)、邁克爾·揚(yáng)(Michael W. Young)，以表彰他們?cè)诮展?jié)律（Circadian rhythms，人們通常也稱其為生物鐘）研究中取得的成就。他們用果蠅作為模式生物，克隆得到第一個(gè)生物鐘基因，period（周期基因），并且發(fā)現(xiàn)周期基因所表達(dá)的周期蛋白會(huì)在晚上積累，白天則會(huì)降解，周期蛋白濃度會(huì)隨著晝夜節(jié)律呈現(xiàn)規(guī)律性的24小時(shí)周期變化，從而提出控制近日節(jié)律的分子機(jī)制，轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路。
?2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主杰弗里·霍爾、邁克爾·羅斯巴什、邁克爾·揚(yáng)
看到這個(gè)獎(jiǎng)項(xiàng)的頒布，我為三位前輩高興的同時(shí)，想起了生物鐘領(lǐng)域中的“另類”成員，藍(lán)綠細(xì)菌（或稱為藍(lán)藻）的生物鐘，一個(gè)不以轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路驅(qū)動(dòng)生物鐘運(yùn)行的分子機(jī)制。當(dāng)然，“另類”或是凡夫俗子們對(duì)藍(lán)綠細(xì)菌生物鐘的看法。有人則視其為生物鐘研究的“先驅(qū)”，一如現(xiàn)代遺傳學(xué)之父孟德爾的遺傳定律當(dāng)年并不能被人理解，直到20世紀(jì)，人們才能理解“孟德爾遺傳定律”的意義。
人們對(duì)自然界的生物存在一個(gè)內(nèi)源的生物鐘的認(rèn)識(shí)由來已久，但一直認(rèn)為生物鐘僅存在于高等生物中，因?yàn)榇蠖鄶?shù)高等生物的細(xì)胞分裂周期接近24小時(shí)，正好與生物鐘的周期相近，而對(duì)于分裂時(shí)間遠(yuǎn)小于24小時(shí)的原核生物（例如大腸桿菌的分裂速度可以快至20分鐘一代），人們不假思索地就排除了其存在晝夜振蕩的生物鐘。但是，研究藍(lán)綠細(xì)菌的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，固氮反應(yīng)與氧氣的存在是不相容的，而藍(lán)綠細(xì)菌是地球上進(jìn)行光合作用最大的物種群之一。就有人們開始推測(cè)，藍(lán)綠細(xì)菌的固氮反應(yīng)與光合作用發(fā)生于一天中不同的時(shí)間（即生物鐘常常所說的相位）。不久，這個(gè)猜想得到證實(shí)，海洋藍(lán)綠細(xì)菌聚球藻(Synechococcus)的光合作用在白天進(jìn)行，而固氮作用在夜間進(jìn)行，并且是內(nèi)源存在的[1]，這是典型的生物鐘現(xiàn)象。
此時(shí)，卡爾·約翰遜(Carl H. Johnson) 完成了他在伍德蘭德·黑斯廷斯（Woodland Hastings，美國(guó)科學(xué)院院士、海洋生物學(xué)及生物熒光領(lǐng)域?qū)＜遥?/span>實(shí)驗(yàn)室的博士后研究，來到范德堡大學(xué)(Vanderbilt University)開展他的研究工作。眼光敏銳的約翰遜注意到了被人們忽視的藍(lán)綠細(xì)菌，很快他就與世界頂尖的兩位科學(xué)家，分子遺傳學(xué)家蘇珊·戈?duì)栴D(Susan S. Golden)和植物生理學(xué)家近藤孝南(Takao Kondo)，以藍(lán)綠細(xì)菌為模式生物開始了合作。他們?nèi)?998年在Science上發(fā)表的文章中，克隆了重要的藍(lán)綠細(xì)菌生物鐘基因：kaiA，kaiB和kaiC。并且，基于霍爾和羅斯巴什在90年代初提出的轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路理論，他們提出藍(lán)綠細(xì)菌生物鐘運(yùn)行的負(fù)反饋分子模型[2]。而高等哺乳動(dòng)物的第一個(gè)生物鐘基因，clock（鐘基因），剛剛于1997年被約瑟夫·高橋(Joseph S. Takahashi)克隆得到[3]。
?卡爾·約翰遜、蘇珊·戈?duì)栴D、近藤孝南
天下沒有不散的宴席，三個(gè)合作良好的科學(xué)家選擇了“分家”，一個(gè)做生物鐘的輸入信號(hào)，一個(gè)做生物鐘的輸出路徑，一個(gè)做生物鐘的分子機(jī)制。時(shí)間過得很快，其間生物鐘領(lǐng)域的成果層出不窮，每年的會(huì)議報(bào)告都讓聽眾興奮不已。2005年，近藤孝南課題組在Science雜志發(fā)表了震動(dòng)世界生物鐘甚至生物學(xué)領(lǐng)域的成果，完全拋開了“轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路”理論，報(bào)道了一種簡(jiǎn)單至極的生物化學(xué)反應(yīng)，解釋了藍(lán)綠細(xì)菌生物鐘的運(yùn)行本質(zhì)[4]。
簡(jiǎn)單來說，近藤教授的課題組發(fā)現(xiàn)，原先認(rèn)為要通過負(fù)反饋才能振蕩的三個(gè)生物鐘組分可以通過純粹的生化反應(yīng)產(chǎn)生振蕩。KaiA，KaiB和KaiC三種蛋白混合在一起，無需轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，在能量供體（ATP）存在的情況下，KaiC蛋白的磷酸化會(huì)展現(xiàn)出近日節(jié)律振蕩。KaiC的磷酸化位點(diǎn)有2個(gè)，分別是431位的絲氨酸和432位的蘇氨酸。讀者可以從下面的蛋白電泳膠圖中看到KaiC蛋白的動(dòng)態(tài)磷酸化變化，其中KaiC蛋白的四條蛋白電泳條帶的周期變化接近24小時(shí)（上面的三條帶是磷酸化的KaiC）。這個(gè)發(fā)現(xiàn)非常完美，將沒有生命的化學(xué)分子變化和生命現(xiàn)象（24小時(shí)的生物鐘）聯(lián)系在一起，體現(xiàn)了生命的本質(zhì)。
?KaiC蛋白的動(dòng)態(tài)磷酸化呈現(xiàn)周期性變化規(guī)律。來源：秦曦明
約翰遜和同在范德堡大學(xué)的馬丁·艾格里(Martin Egli)展開合作，純化并結(jié)晶了藍(lán)綠細(xì)菌的KaiC蛋白，順利解析其三維結(jié)構(gòu)，是一個(gè)完美對(duì)稱的正六聚體，從頂部看上去，像一個(gè)完美的時(shí)鐘。隨著近年冷凍電鏡技術(shù)（2017年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）的發(fā)展，更高分辨率的KaiC及其與KaiA和KaiB復(fù)合物的結(jié)構(gòu)得到解析，為理解KaiC磷酸化的近日節(jié)律提供了清晰的注釋[5]。下圖的中心是正六聚體的KaiC蛋白，每個(gè)KaiC亞基結(jié)合1個(gè)KaiB單體，再結(jié)合2個(gè)KaiA單體，組成對(duì)稱結(jié)構(gòu)。
?KaiCBA復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)示意圖。PDB ID：5N8Y
至此，藍(lán)綠細(xì)菌生物鐘作為一個(gè)從轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路模型的“局內(nèi)人”，完全成為自成一體的“不依賴轉(zhuǎn)錄的生化振蕩器”。本屆諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)得主，羅斯巴什，認(rèn)為藍(lán)綠細(xì)菌的生物鐘與高等生物的進(jìn)化起源不同。但是科學(xué)家基于藍(lán)綠細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)，近年在高等生物里發(fā)現(xiàn)了不依賴轉(zhuǎn)錄翻譯負(fù)反饋環(huán)路的近日節(jié)律振蕩[6]，為生物機(jī)體生物鐘的統(tǒng)一認(rèn)識(shí)打開了一扇新的窗戶。
誰(shuí)又能斷言，藍(lán)綠細(xì)菌的生物鐘運(yùn)行的不依賴轉(zhuǎn)錄翻譯的分子機(jī)制，會(huì)不會(huì)如同愛因斯坦在1916年所提出的引力波概念（2017年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)，但受到物理學(xué)家?guī)资甑馁|(zhì)疑），在未來被發(fā)現(xiàn)是統(tǒng)一存在于所有的生物機(jī)體之中。
參考文獻(xiàn)：
1. Mitsui A, Kumazawa S, Takahashi A, Ikemoto H, Cao S, Arai T. (1986) Strategy by which nitrogen-fixing unicellular cyanobacteria grow photoautotrophically. Nature. 323: 720-722.
2. Ishiura M, Kutsuna S, Aoki S, Iwasaki H, Andersson CR, Tanabe A, Golden SS, Johnson CH, Kondo T.(1998) Expression of a gene cluster kaiABC as a circadian feedback process in cyanobacteria. Science. 281:1519-1523.
3. King DP, Zhao Y, Sangoram AM, Wilsbacher LD, Tanaka M, Antoch MP, Steeves TD, Vitaterna MH, Kornhauser JM, Lowrey PL, Turek FW, Takahashi JS. (1997) Positional cloning of the mouse circadian clock gene. Cell. 89: 641-653.
4. Tomita J, Nakajima M, Kondo T, Iwasaki H. (2005) No transcription-translation feedback in circadian rhythm of KaiC phosphorylation. Science. 307: 251-254.
5. Snijder J, Schuller JM, Wiegard A, L?ssl P, Schmelling N, Axmann IM, Plitzko JM, F?rster F, Heck AJ. (2017) Structures of the cyanobacterial circadian oscillator frozen in a fully assembled state. Science. 355:1181-1184.
6. O'Neill JS, Reddy AB. (2011) Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469: 498-503.
