成年人的大腦里面還有沒(méi)有神經(jīng)干細(xì)胞存在？| 圖源：pixabay.com

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成年人的大腦里面還有沒(méi)有神經(jīng)干細(xì)胞存在，這些神經(jīng)干細(xì)胞是否還能繼續(xù)生成新的神經(jīng)元？過(guò)去10多年，業(yè)內(nèi)人普遍認(rèn)為，存在；然而，近幾年的一些研究卻認(rèn)為，不存在。

一般來(lái)說(shuō)，證明存在，比較簡(jiǎn)單；證明不存在，可能工作量就比較大，需要更嚴(yán)格的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)得起統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的考驗(yàn)。

無(wú)論如何，當(dāng)神經(jīng)發(fā)育結(jié)束后，成熟的人類(lèi)大腦一共有大約800億神經(jīng)元和800億神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，要在所有這些細(xì)胞中尋找神經(jīng)干細(xì)胞，是很有挑戰(zhàn)的。

撰文｜錢(qián)誠(chéng)   周峰泉（約翰霍普金斯大學(xué)）

責(zé)編｜邸利會(huì)

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成年人大腦中是否有神經(jīng)干細(xì)胞，科學(xué)家關(guān)注這個(gè)問(wèn)題，有兩個(gè)簡(jiǎn)單的理由。

首先，如果成年人的大腦中還存在著神經(jīng)干細(xì)胞，并且能夠通過(guò)某種方法刺激這些神經(jīng)干細(xì)胞分裂增殖，并重新分化為神經(jīng)元，可能是一種非常有效的治療神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的新療法。

神經(jīng)元受到損傷或疾病侵?jǐn)_后會(huì)死亡。許多神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥，帕金森綜合癥等疾病，主要病理后果是神經(jīng)元的死亡。神經(jīng)元的死亡是導(dǎo)致認(rèn)知功能下降的主要原因。

因?yàn)樯窠?jīng)元無(wú)法重新分裂產(chǎn)生新的神經(jīng)元，目前針對(duì)人類(lèi)大腦損傷或者神經(jīng)退行性疾病，基本缺少有效的治療方法。

另外，過(guò)去大概20年，許多實(shí)驗(yàn)室研究了成年小鼠大腦中神經(jīng)干細(xì)胞的功能。

他們發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠大腦中的海馬區(qū)部位有不少的神經(jīng)干細(xì)胞。這些成年神經(jīng)干細(xì)胞與神經(jīng)發(fā)育期間的神經(jīng)干細(xì)胞相似，可以繼續(xù)分裂，產(chǎn)生更多的神經(jīng)干細(xì)胞，同時(shí)也可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且分化后的神經(jīng)元可以整合到已經(jīng)形成的神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮功能。

另外，其他一系列研究表明，如果對(duì)小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)或智力訓(xùn)練，小鼠的許多高級(jí)認(rèn)知功能，如學(xué)習(xí)和記憶能力，就會(huì)有明顯增加。

大家一致認(rèn)為，小鼠大腦中的海馬區(qū)域是負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，進(jìn)一步的研究表明，在海馬區(qū)域的神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)小鼠認(rèn)知功能的提高起著非常重要的作用。

基于這些研究結(jié)果，大家認(rèn)為，成年動(dòng)物大腦中存在的神經(jīng)干細(xì)胞及其產(chǎn)生新生神經(jīng)元的能力，也是大腦神經(jīng)可塑性的一個(gè)重要組成部分。

由此推斷，如果成年人的大腦中也存在類(lèi)似的神經(jīng)干細(xì)胞，也可以通過(guò)運(yùn)動(dòng)或者智力訓(xùn)練來(lái)增加自己的認(rèn)知能力，或者說(shuō)變得更加聰明。

人類(lèi)大腦的樣品主要有兩個(gè)來(lái)源, 最常見(jiàn)的是由死者家屬捐獻(xiàn)的大腦組織。另外，部分患有腦部疾病的病人在治療過(guò)程中需要做部分腦組織切除手術(shù)，切除出來(lái)的大腦組織，經(jīng)病人及其家屬同意，也是樣品的另一個(gè)主要來(lái)源。

由于樣品來(lái)源的特殊性，對(duì)樣品進(jìn)行任何預(yù)處理的可能性雖然有，但是很低?？偨Y(jié)下來(lái)，目前大概有以下幾種方法尋找并鑒定人類(lèi)大腦神經(jīng)干細(xì)胞。

一是，直接尋找神經(jīng)干細(xì)胞。

成年的神經(jīng)干細(xì)胞與胚胎發(fā)育期間的神經(jīng)干細(xì)胞基本類(lèi)似（包括特異性蛋白，所處腦區(qū)，和轉(zhuǎn)錄組特征等）。神經(jīng)干細(xì)胞可以分裂，且含有一些在神經(jīng)干細(xì)胞中相對(duì)特異表達(dá)的蛋白質(zhì)（標(biāo)志蛋白）。

其次，可以尋找由神經(jīng)干細(xì)胞分化而產(chǎn)生的新神經(jīng)元。與原有的老的神經(jīng)元相比，這些新生成的神經(jīng)元也表達(dá)一些相對(duì)特異的標(biāo)志蛋白。

第三種是首先通過(guò)標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記所有正在分裂的細(xì)胞（如Brdu, Bromodeoxyuridine, 中文名是溴脫氧腺苷。它是DNA中脫氧胸苷的類(lèi)似物，可以在細(xì)胞分裂時(shí)參入新和成的DNA中，常用于檢測(cè)分裂的活細(xì)胞），然后過(guò)一段時(shí)間再尋找含有這些標(biāo)記物、同時(shí)也表達(dá)神經(jīng)元特異性蛋白的細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞就是由神經(jīng)干細(xì)胞分化而產(chǎn)生的神經(jīng)元。

以上三種方法主要是通過(guò)抗體染色實(shí)驗(yàn)完成的。

最后，通過(guò)對(duì)大腦特定區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，可以得到每個(gè)細(xì)胞樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)對(duì)該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息分析，可以幫助我們鑒定具有神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的細(xì)胞。

雖然實(shí)驗(yàn)手段經(jīng)歷了幾個(gè)技術(shù)世代—— 從組織切片原位免疫染色為主、分散細(xì)胞染色后通過(guò)流式儀計(jì)數(shù)，到整批細(xì)胞混在一起核酸測(cè)序（bulk tissue RNA-seq），再到單細(xì)胞（核）RNA測(cè)序（見(jiàn)下表）—— 關(guān)于成年人大腦海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞究竟存在與否，以及有無(wú)內(nèi)源成年神經(jīng)生發(fā)，至今尚沒(méi)有共識(shí)見(jiàn)解。

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科學(xué)技術(shù)總有瑕疵，但伴隨更多數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)生，以及多種不同技術(shù)的相互輔證（比如FISH RNAscope（RNA原位雜交技術(shù)）和multiplex免疫染色（多試幾種抗體）聯(lián)合），技術(shù)層面的障礙會(huì)越來(lái)越小。

如果采用染色的策略，那每一個(gè)細(xì)胞染出來(lái)了就捕獲了那個(gè)細(xì)胞，剩下的就是通過(guò)什么標(biāo)準(zhǔn)去給每個(gè)細(xì)胞身份賦值定性為神經(jīng)干細(xì)胞。

定錯(cuò)了，無(wú)非制造兩個(gè)結(jié)果，不是假陽(yáng)性，就是假陰性。如果不考慮抗體質(zhì)量糟糕結(jié)合了靶目標(biāo)之外的其它蛋白這種技術(shù)障礙，剩下的問(wèn)題就是——

除了經(jīng)典的細(xì)胞標(biāo)志蛋白染色技術(shù)，我們認(rèn)為通過(guò)新技術(shù)單細(xì)胞測(cè)序研究細(xì)胞身份應(yīng)該是一個(gè)更準(zhǔn)確的方法。

那么，單細(xì)胞（核）測(cè)序能不能捕獲上面通過(guò)染色實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)上表）發(fā)現(xiàn)的那些成年人腦神經(jīng)干細(xì)胞（若有）？

理論上應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題。

染色實(shí)驗(yàn)是通過(guò)抗體直接檢測(cè)蛋白質(zhì)，而核酸測(cè)序是檢測(cè)編碼蛋白的信使RNA。目前默認(rèn)設(shè)置的常規(guī)測(cè)序深度通常能在每個(gè)細(xì)胞（核）平均測(cè)到3、4千個(gè)表達(dá)基因，當(dāng)然增加開(kāi)銷(xiāo)可以測(cè)得更深。染色實(shí)驗(yàn)一般最多染3、4個(gè)蛋白，而且通常這些蛋白標(biāo)志物表達(dá)量不會(huì)太低，所以編碼它們的RNA應(yīng)該能被單細(xì)胞（核）測(cè)序抓到。

如果只關(guān)心3、4個(gè)基因表達(dá)，那么細(xì)胞（核）的測(cè)序，從某種角度上看就相當(dāng)于針對(duì)20萬(wàn)細(xì)胞樣品通過(guò)檢測(cè)3、4個(gè)細(xì)胞標(biāo)志物來(lái)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞（此外，除了鑒定細(xì)胞類(lèi)型，單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果通過(guò)大數(shù)據(jù)分析也可以推斷細(xì)胞分裂的情況，能分裂也是干細(xì)胞的特點(diǎn)之一）。

那么具體如何通過(guò)單細(xì)胞（核）mRNA測(cè)序鑒定細(xì)胞類(lèi)型？

首先，利用每個(gè)細(xì)胞平均測(cè)到的3、4千個(gè)表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄組為依據(jù)，我們可以在相對(duì)高數(shù)量的維度上通過(guò)大數(shù)據(jù)分析將彼此相似的細(xì)胞歸并為一類(lèi)，就是聚類(lèi)分析。

在捕獲細(xì)胞（核）數(shù)量足夠，測(cè)序深度良好的情況下，每類(lèi)細(xì)胞還可以再細(xì)分成一些亞型。雖然所用軟件或計(jì)算方法可能不同，聚類(lèi)分析本身是一個(gè)基于關(guān)聯(lián)性的無(wú)偏過(guò)程。

但對(duì)于分出來(lái)的每個(gè)類(lèi)別（cluster）的細(xì)胞身份認(rèn)定最終還是人定的，并且這是個(gè)極度依賴(lài)先驗(yàn)知識(shí)的步驟。

具體來(lái)說(shuō)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析可以算出每個(gè)cluster表達(dá)明顯高的50到100個(gè)基因，再根據(jù)這些基因里有什么已知細(xì)胞類(lèi)型的幾個(gè)標(biāo)志物來(lái)決定這個(gè)cluster的身份，最后可以再結(jié)合FISH或者抗體染色去復(fù)證。

當(dāng)然這50到100個(gè)基因中還有希望發(fā)現(xiàn)新穎的，更純的細(xì)胞身份標(biāo)志物。同理，單細(xì)胞測(cè)序后的聚類(lèi)分析也可以重新驗(yàn)證某些傳統(tǒng)的細(xì)胞身份標(biāo)志物是否確實(shí)不在其它細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)（細(xì)胞特異性）。比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發(fā)現(xiàn)在成年人腦海馬區(qū)中，常用的新生神經(jīng)元標(biāo)志蛋白Dcx不僅僅是未成熟新生神經(jīng)元的標(biāo)志。

由于人類(lèi)大腦樣品來(lái)源不易，大多數(shù)情況下只能在單一時(shí)間點(diǎn)取樣，而不像動(dòng)物模型那樣可以獲得幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)real-time的樣品。但是即使在單一時(shí)間點(diǎn)，同一組織內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的狀態(tài)也略有差別。換一句說(shuō)，在一群細(xì)胞中會(huì)存在處于某個(gè)生物過(guò)程中不同階段的細(xì)胞亞群。

現(xiàn)有的大數(shù)據(jù)分析技術(shù)可以通過(guò)一個(gè)稱(chēng)為Pseudo-time trajectory的分析方法從單一時(shí)間點(diǎn)取樣的單細(xì)胞（核）測(cè)序數(shù)據(jù)中，找到這些細(xì)胞亞群，從而模擬整個(gè)生物過(guò)程。

比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 就發(fā)現(xiàn)通過(guò)分析成年小鼠，豬，恒河猴的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，可以描繪一條從Neural intermediate progenitor cells（神經(jīng)干細(xì)胞），到新生神經(jīng)元，再到成熟神經(jīng)元 （granule cell）的一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞分化成長(zhǎng)的過(guò)程。然而在同樣條件下，研究者們?cè)诔赡耆祟?lèi)大腦海馬區(qū)就測(cè)不到這個(gè)細(xì)胞過(guò)程。基于此結(jié)果，該研究認(rèn)為在這些人類(lèi)大腦樣品中不存在神經(jīng)干細(xì)胞。

2021年發(fā)表在Neuron 雜志這兩篇單細(xì)胞核測(cè)序文章 [1,2] 均聚焦探尋成年人腦海馬區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞和新生神經(jīng)元。結(jié)果簡(jiǎn)言之，都沒(méi)找到。

在成年人海馬腦區(qū)齒狀回區(qū)域探尋神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)生發(fā)過(guò)程，是因?yàn)樵缦葘?shí)驗(yàn)在成年哺乳動(dòng)物，比如嚙齒目中的小鼠，非人靈長(zhǎng)類(lèi)，以及幼年人類(lèi)海馬區(qū)齒狀回發(fā)現(xiàn)了顯著的新生神經(jīng)元蹤跡，或者至少存在神經(jīng)元生發(fā)過(guò)程。

至于成年人大腦中神經(jīng) “干細(xì)胞”，如果存在，目前大家普遍認(rèn)為它們存在的區(qū)域和其它特性與其它動(dòng)物模型中和幼年人類(lèi)腦中發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞類(lèi)似。這一先入為主的觀點(diǎn)是否正確或限制了我們的視野，因?yàn)闆](méi)有先驗(yàn)依據(jù)，暫時(shí)無(wú)法回答，但值得關(guān)注。

單細(xì)胞（核）mRNA測(cè)序也不是完美無(wú)瑕的，通常缺點(diǎn)恰恰出自?xún)?yōu)點(diǎn)。

單細(xì)胞測(cè)序同樣依賴(lài)先驗(yàn)知識(shí)來(lái)給細(xì)胞身份賦值定性。分析的時(shí)候選定幾個(gè)參數(shù)之后，聚類(lèi)是可以由計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算完成的。但是把每個(gè)cluster認(rèn)定成什么細(xì)胞類(lèi)型、亞型、狀態(tài)，仍然是需要人為依照先驗(yàn)標(biāo)志去賦值。

打個(gè)比方，如果蒙上眼睛去摸比如20萬(wàn)只動(dòng)物，每個(gè)有3、4千特征值（甚至多些達(dá)到上萬(wàn)個(gè)特征），就可以把比如大象分成一堆，長(zhǎng)頸鹿，綿羊，貓狗，禽類(lèi)，魚(yú)類(lèi)各自成堆，分析的細(xì)一些還可以把貓和狗，雞鴨鵝繼續(xù)分開(kāi)。

我們之所以能夠身份賦值成功，是因?yàn)橄闰?yàn)知識(shí)，我們本來(lái)就認(rèn)識(shí)這些動(dòng)物。試想如果我們?cè)炔徽J(rèn)識(shí)羊駝這種動(dòng)物，數(shù)量又不大，那就很有可能把比如7、8只羊駝分到綿羊一堆里，也就是假陰性：沒(méi)有羊駝。

同理，如果成年人腦神經(jīng)干細(xì)胞與小鼠、豬、猴子、人類(lèi)幼年的這些先驗(yàn)知識(shí)都不相似呢？

比如，2021年Neuron 雜志這篇文章 [1] 這20萬(wàn)細(xì)胞核已經(jīng)成功捕獲了神經(jīng)干細(xì)胞，但是沒(méi)有認(rèn)出來(lái)（假陰性），卻隱匿在了星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，少突細(xì)胞，interneuron群里。

好在成年人腦神經(jīng)干細(xì)胞一旦被單細(xì)胞測(cè)序成功捕獲了，隨著技術(shù)進(jìn)步可以測(cè)更高通量的細(xì)胞和測(cè)序深度增加（各個(gè)平臺(tái)都有這樣新的解決方案推出），這個(gè)干細(xì)胞cluster理論上應(yīng)該冒出來(lái)。雖然也許這個(gè)cluster會(huì)與，比如，膠質(zhì)細(xì)胞或者內(nèi)皮細(xì)胞共用很多個(gè)標(biāo)志基因，但測(cè)序分辨率夠了應(yīng)該能找到區(qū)別。

更為重要的，成年神經(jīng)元生發(fā)作為一個(gè)過(guò)程，軌跡（trajectory）應(yīng)該是存在、可測(cè)且清晰。

因?yàn)槿绻罱K發(fā)現(xiàn)某些astrocytes或者microglia類(lèi)細(xì)胞有神經(jīng)干細(xì)胞功能，它們不可能瞬間身份轉(zhuǎn)換成與某種原有成年腦細(xì)胞一模一樣，所以通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)該可以鑒定出來(lái)。

就算轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的聚類(lèi)和軌跡分析都不能賦值鑒定成年神經(jīng)干細(xì)胞（若存在，且捕獲），那還可以嘗試基于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)和軌跡分析，包括增強(qiáng)子enhancer特征，等等。在多組學(xué)這個(gè)趨勢(shì)下，單細(xì)胞（核）DNA甲基化特征，lncRNA特征，單細(xì)胞ChIP-seq也早晚都會(huì)進(jìn)入市場(chǎng)成為有用的工具。

如果以上方法還是無(wú)法找到成年神經(jīng)干細(xì)胞，說(shuō)明什么？

一個(gè)可能性是成年人腦中的類(lèi)干細(xì)胞和類(lèi)神經(jīng)元生發(fā)過(guò)程在正常生理狀態(tài)下處于靜息或受抑制狀態(tài)。

例如，最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠大腦的海馬區(qū)衰老的神經(jīng)干細(xì)胞抑制了其附近正常干細(xì)胞的分裂和分化功能。通過(guò)化學(xué)手段去除老化的干細(xì)胞可以大大促進(jìn)正常神經(jīng)干細(xì)胞的分裂與分化。

同理，成年人類(lèi)大腦中的神經(jīng)干細(xì)胞可能也是需要某些條件激活的，比如損傷，某種疾病，特定遺傳，或者環(huán)境背景。這類(lèi)的調(diào)節(jié)未必是線(xiàn)性的也許是個(gè)動(dòng)力系統(tǒng)，所以前途仍然是光明的。

隨著更多數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，特別是那些染色找到成年人腦神經(jīng)干細(xì)胞的課題組，可應(yīng)用多組學(xué)單細(xì)胞（核）測(cè)序來(lái)確證自己的發(fā)現(xiàn)。

舊的bulk tissue mRNA-seq也是個(gè)寶庫(kù)（通常都存在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)），因?yàn)楹芏嗍悄撤N背景或者損傷的樣品，未必能找到同等的再去做單細(xì)胞測(cè)序。結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序標(biāo)志庫(kù)，現(xiàn)在有很多建立的數(shù)據(jù)分析流程 [3] 可以把bulk-seq做反卷積（deconvolution）看其中各個(gè)細(xì)胞成分的差異基因。

另外，經(jīng)常聽(tīng)到的單細(xì)胞測(cè)序的其它缺陷，比如組織酶解消化過(guò)程會(huì)改變細(xì)胞狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄組，或者造成transcripts丟失。我們自己的經(jīng)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)成年動(dòng)物腦組織酶解消化過(guò)程，如果條件沒(méi)有最佳化，會(huì)造成大量細(xì)胞丟失。

新推出的一些測(cè)序方案也許可以克服這些缺陷，使得測(cè)量結(jié)果更加原汁原味。

比如，spatial sequencing可以將組織切片的 “像素點(diǎn)” 不經(jīng)酶消化直接原位轉(zhuǎn)化成 “單細(xì)胞” 再測(cè)序。又如單細(xì)胞測(cè)序后通過(guò)組織切片F(xiàn)ISH RNAscope驗(yàn)證可以找到不受樣品消化影響的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

成年人大腦中約有800億個(gè)神經(jīng)元，以及大約等同或稍多數(shù)量的膠質(zhì)細(xì)胞和其它細(xì)胞。

嚴(yán)格來(lái)講，要知道這每人1600億個(gè)細(xì)胞群體中 “有” 還是 “沒(méi)有” 神經(jīng)干細(xì)胞和成年新生神經(jīng)元，如果找到了要下結(jié)論 “有”，那么一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是如何確定找到的細(xì)胞是神經(jīng)干細(xì)胞？這1600億細(xì)胞群體中，神經(jīng)干細(xì)胞大概占多少？

如果沒(méi)找到，下結(jié)論 “沒(méi)有”，那么一個(gè)重要的問(wèn)題是樣品的覆蓋率和數(shù)量是否足夠？比如用單細(xì)胞測(cè)序，每次抽樣20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，要測(cè)多少次才能下結(jié)論？要考慮是否經(jīng)得起統(tǒng)計(jì)學(xué)方面的檢驗(yàn)。

在多組學(xué)大數(shù)據(jù)的時(shí)代，讓成年人腦神經(jīng)干細(xì)胞探尋的子彈再飛一會(huì)兒。

 參考文獻(xiàn)：

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