基因治療病毒載體有毒？這種方法可降低對神經細胞的毒性
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隨著生命科學與醫(yī)學的發(fā)展，基因治療逐漸走進人們的視野?；蛑委熤饕轻槍δ切╇y以用化學藥物根治的、對人類健康存在威脅的疾病，包括遺傳病（如脊肌萎縮癥、地中海貧血癥）、惡性腫瘤、心血管疾病、阿爾茨海默癥與免疫缺陷等。
目前，許多體內基因治療的方法都是以腺相關病毒（AAV）為載體。腺相關病毒是一種結構簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，通常需要輔助病毒的幫助才能產生毒性?；蛑委熗ǔ⒅委熜缘霓D基因或基因編輯工具包裝進腺相關病毒，然后將之遞送至患者靶細胞核內，隨后腺相關病毒內部編碼病毒蛋白的DNA將被刪掉，取而代之的是治療性轉基因，從而實現(xiàn)基因治療。
雖然AAV在應用于基因治療時具有諸多優(yōu)點，但在治療神經系統(tǒng)遺傳疾病時有潛在的致病性，會導致新的問題。已有的研究表明，無論是將AAV載體通過靜脈注射入豬的血液中 [1]，還是將其通過小腦延髓池穿刺（ICM）注入非人靈長類動物的腦脊液中 [2,3]，都會對動物的背根神經節(jié)（DRG）產生嚴重毒性，這種毒性會導致神經退行性疾病，嚴重時甚至可產生共濟失調癥。
針對此問題，來自美國賓夕法尼亞大學的詹姆斯·M·威爾森（James M·Wilson）教授開發(fā)出一種新的方法，避免在使用AAV作為載體治療此類疾病時對背根神經節(jié)的毒性。該方法于11月11日發(fā)表在《科學-轉化醫(yī)學》（Science Translational Medicine）雜志上 [4]。
我們先來了解一下背根神經節(jié)為什么會因AAV載體 “中毒”。背根神經節(jié)是一種聚集在脊髓外側的感覺神經元（圖1.A），對AAV載體有著特殊的親和力。因此，這些神經細胞被過多AAV載體轉導后會進行超負荷的轉錄和蛋白合成，導致細胞應激，使衛(wèi)星細胞反應性增殖并分泌細胞因子，繼而吸引淋巴細胞，這一連串反應最終會導致細胞死亡（圖2）。
“隨著我們在基因治療領域的不斷進步，尤其是在治療非致命性疾病方面的進步，我們會有一些安全顧慮，而這些安全顧慮將超過通過治療收獲的益處”，本研究的通訊作者威爾森說。[5]
雖然藥物可以減輕機體對AAV載體和轉基因產物的免疫反應，但并無法消除其對背根神經節(jié)的毒性和軸突病變 [2,3]。那么，是否可以通過某種方法來使這種情況得到改善呢？
為此，威爾森團隊設計了一種新的方法，從而大大降低AAV載體對這種神經細胞的毒性。
結合早期嘗試與對各種方法的評估，作者最終選定了以下方案：讓背根神經節(jié)中的AAV載體沉默。
怎么才能讓背根神經節(jié)精準識別出AAV載體并阻止其表達呢？研究者決定在AAV載體中插入的特殊基因片段。我們知道，當一般的編碼DNA想行使其功能時，會先轉錄為單鏈mRNA（信使RNA），才能被翻譯為蛋白質。不過，miRNA（微小RNA）可以與其互補配對的mRNA的特定區(qū)域特異性結合，這樣一來，mRNA就形成了部分雙鏈，而這樣的mRNA會被機體降解掉，從而阻止其繼續(xù)翻譯成蛋白質。
因此，研究團隊在轉基因的終止密碼子和poly-A尾之間插入與背根神經節(jié)中特有miRNA反向互補的四個重復序列（圖3）。如此一來，當AAV攜帶的轉基因轉錄為mRNA，如果miRNA找到鏈條中與其互補的序列并與之結合，基因表達就終止了。四個重復序列可以增加其與背根神經節(jié)中特異miRNA結合的概率，繼而加強其抑制效率，組成一個用于在背根神經節(jié)中沉默AAV的表達盒（expression cassette）。這樣的表達盒不僅可以通過miRNA的特異性識別來沉默轉基因在背根神經節(jié)中的表達，而且在其它不表達特異性miRNA的細胞類型中，蛋白質合成也不會受到影響。
作者最終選擇了一個在背根神經節(jié)中特異性很高的 miRNA183（簡稱miR183）的反向重復序列作為表達盒的插入序列。
表達盒設計好了，它的療效如何呢？
研究團隊首先用恒河猴測試了在AAV載體加入特定片段后，是否會減輕對背根神經節(jié)的毒性。通過小腦延髓池穿刺，研究人員將表達GFP（綠色熒光蛋白）或 GFP-miR183 的AAV載體注射進成年恒河猴體內，在第14天對半數動物進行尸檢，檢測GFP的表達量；在第60天處死剩余動物，評估GFP的表達量與背根神經節(jié)毒性。并且，猴子們在接受AAV注射后，均沒有證據表明其獲得神經性頭痛等臨床后遺癥。
結果如圖4所示，含有miR183靶標的改造載體與對照載體相比，熒光蛋白的表達量在背根神經節(jié)中顯著降低，而在腰椎運動神經元和小腦中顯著提高，在大腦皮質中則無明顯變化。這些現(xiàn)象意味著，含有miR183靶序列載體的蛋白表達僅在背根神經節(jié)中受到了抑制，而在其它神經組織中并未受到抑制。并且當載體中不含有miR183靶位點時，所有區(qū)域都存在病理現(xiàn)象。
之后，研究團隊測試了加入特定序列后，AAV載體的基因治療效果如何。作者使用了表達hIDUA的載體進一步評估了在非人靈長類中miR183靶序列的作用。hIDUA是黏多糖病I型患者體內缺乏的酶，有關這一基因的研究首次報道了非人靈長類中的背根神經節(jié)毒性 [3]。
實驗分為三組，第一組動物僅注射表達hIDUA的載體；第二組在第一組的基礎上加入類固醇藥物進行治療；第三組在表達hIDUA的載體中整合入miR183靶序列。在第90天處死所有動物，評估hIDUA的表達量與背根神經節(jié)毒性。
結果顯示，在第一組和第二組的背根神經節(jié)中檢測到hIDUA的高表達量，在其中樞神經系統(tǒng)的其它區(qū)域檢測到低至中度的hIDUA表達。而在第三組中，將miR183靶序列整合入載體后，不僅阻斷了背根神經節(jié)中hIDUA蛋白的表達，且中樞神經系統(tǒng)中hIDUA蛋白的表達量沒有降低。第三組動物在背根神經節(jié)、脊柱和周圍神經區(qū)域完全沒有出現(xiàn)病理現(xiàn)象，而第一組和第二組動物則恰恰相反、存在病理現(xiàn)象。
以上數據與現(xiàn)象共同說明，研究團隊開發(fā)的方法可以在非人靈長類中減輕基因治療過程中AAV載體誘導的背根神經節(jié)毒性，并且在此基礎上不會降低基因治療的效果。
“我們能夠在保證病毒載體效力的情況下降低或消除其背根神經節(jié)毒性”，威爾森說，“基因治療目前正在對21種不同的疾病進行臨床試驗，另有122種疾病正在進行臨床前研究。在這21種正在進行臨床試驗的治療中，有14種可能具有背根神經節(jié)毒性，而這種改良的AAV載體可能會使該現(xiàn)象有所改善?！?[5]
威爾森的研究小組已經同意將這項技術授權給五家基因治療公司，并正在與另外五家公司進行談判。這種改良技術目前并未應用于臨床，但作者說他希望明年就能實現(xiàn)對此技術的臨床應用。
“這項研究使AAV基因治療向臨床應用邁出重要的一步?！?來自南安普頓大學神經再生領域的科學家梅利莎·安德魯斯（Melissa Andrews）這樣評論該研究，“這種方法看起來并不會降低基因治療的療效，而且作為一種更為安全的治療措施，它將受到臨床治療的歡迎。” [5]
