真相還是假象？神經所楊輝CELL論文再遭質疑
2020年4月，中國科學院神經科學研究所研究員楊輝課題組在Cell 上發(fā)表研究論文。2020年7月，美國加州大學付向東教授舉報楊輝“ “剽竊和涉嫌造假等學術道德不端行為”。造成中國國內學術界軒然大波。一波未平，一波又起，2021年2月1日，美國哈佛大學、霍普金斯大學等校教授（包括美國科學院院士）公開發(fā)表文章，提出多種質疑。海內外神經科學家在本文發(fā)表公開意見。
獨家探爭議｜上海學術新星遭舉報，審稿人現身稱曾拒稿
楊輝再發(fā)聲明：沒有及時交流工作進展，深表歉意
付向東首次回應：與神經所楊輝論文爭議始末
2020年7月，一封舉報信在網上流出。加州大學圣地亞哥分校細胞和分子醫(yī)學系教授付向東實名向中科院、科技部、基金委舉報中科院神經所研究員楊輝，稱其有 “剽竊和涉嫌造假等學術道德不端行為”。被質疑的楊輝的論文于2020年4月30日發(fā)表在Cell 上。
此后，付向東向《知識分子》確認，在與神經所溝通，希望提供DNA引物訂單證據無果后，確實投遞了這封舉報信。盡管楊輝也通過其他媒介作出了回應，但付向東卻認為 “明顯避重就輕、文過飾非”。言外之意，沒有正面回應他的質疑。
數月過后，當兩人的爭議漸趨平靜時，神經再生領域的多位專家卻依然發(fā)表文章，懷疑楊輝的那篇Cell 論文中看到的可能是假象，部分結論需要獨立的重復檢驗。
那么，疑點在哪呢？
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在最常見的三種視網膜疾病中，老年黃斑變性、糖尿病性視網膜病變會導致作為光感受器的視桿和視錐細胞喪失；青光眼會導致視網膜神經節(jié)細胞丟失。這三種視網膜神經元的丟失造成了大部分不可逆轉的眼盲。單在美國，這三種疾病共折磨了近1500萬人，并且隨著人口老齡化，其患病率也在增加。
那么，如果有療法可以讓這些丟失的視網膜神經元再生，就有很重要的臨床意義。
2020年4月，澳門科技大學教授張康和付向東等合作發(fā)表文章，在敲低視網膜膠質細胞穆勒（Müller）細胞的某種蛋白質PTBP1的表達后，發(fā)現穆勒細胞轉變成了視錐細胞，且視錐參與的光反應顯著恢復。
緊接著4月30日發(fā)表的楊輝Cell 論文，用了不同的技術手段，同樣敲低了穆勒細胞中同一個PTBP1的表達，卻將穆勒細胞轉化為了視網膜神經節(jié)細胞。
2021年2月1日出版的The Journal of Clinical Investigation 上，發(fā)表了約翰霍普金斯大學教授 Seth Blackshaw 和哈佛大學教授 Josh Sanes 的觀點文章（以下簡稱JCI文），二人在考察了最近出現的一些看起來很 “給力” 的研究后，發(fā)現不少矛盾之處，其中就涉及到上述兩篇研究，作者指出——
都是一樣敲低了視網膜穆勒細胞中PTBP1的表達，穆勒細胞卻轉化成了不同類型的神經元——一個是視錐細胞，一個是視網膜神經節(jié)細胞，這種不同需要解釋。
Blackshaw和Sanes都是研究視覺系統(tǒng)發(fā)育、損傷和再生的資深專家，后者是美國科學院院士。
事實上，除了JCI文指出的這點不同，付向東于2020年6月24日發(fā)表的Nature 論文的部分結論和楊輝這篇Cell 論文更有著直接的矛盾。
比如，付向東是通過RNA干擾技術降低PTBP1基因表達，在帕金森小鼠中腦的黑質致密部，把星型膠質細胞轉變成了多巴胺能神經元，并進一步投射到紋狀體。
而楊輝則是通過基因編輯技術，敲低PTBP1基因表達，直接在帕金森小鼠腦中的紋狀體區(qū)域，把星型膠質細胞轉變成了多巴胺能神經元。
然而，除了在中腦外，付向東還在其它腦區(qū)多做了些驗證，結果發(fā)現，在小鼠紋狀體星形膠質細胞中敲降PTBP1并不能夠再生出多巴胺能神經元。
這與楊輝的結論直接沖突。
“紋狀體里95%都是GABAergic神經元，所有有轉分化的文章得到的都是這類的神經元，只有加了多巴胺能神經元特有的因子才能得到一定量的多巴胺能神經元。有經驗的人一眼就能看出楊輝的細胞都是些死細胞。大家都知道抗體很容易附著在死細胞上，因而得出不合常理的結論?！?付向東向《知識分子》表示。
楊輝的結果也讓另外一些神經科學家感到驚訝。
“紋狀體內的神經元主要都是GABAergic的（神經元），在這樣的微環(huán)境下，紋狀體的膠質細胞理論上變成GABAergic神經元的可能性會比較大。如果要變成多巴胺神經元，我想應該需要一些特定的因子來推動?！?暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院教授陳功告訴《知識分子》。
他還進一步表示， 如果在紋狀體里再生了多巴胺神經元，應該深入了解這些本來不存在的、突然出現的多巴胺神經元，是否可能會對紋狀體的局部神經環(huán)路、乃至更廣泛的大腦神經環(huán)路產生不良影響。
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除了這些直接的矛盾，楊輝的論文還有其他令人驚訝的地方。
在他的論文中，不僅穆勒細胞轉化為了視網膜神經節(jié)細胞，且新生的細胞軸突也能夠迅速通過視神經投射到外側膝狀體核（LGN）和上丘（SC）并修復了模型動物損傷的視覺功能。
JCI文的作者提醒到，成年哺乳動物視網膜當中的軸突化的視網膜神經節(jié)細胞的再生效率是比較低的，且再生軸突的數量也是很有限的，也很少會達到中央目標（central targets）。
“軸突生長和其它中間狀態(tài)相比，時間更長，應該比較容易觀察并記錄下來。對長距離軸突投射神經元來說，產生新的神經元只是功能恢復的第一步，后期軸突生長，導向，突觸形成，和髓鞘形成每一步都必不可少。” 約翰霍普金斯大學醫(yī)學院教授周峰泉告訴《知識分子》，在軸突再生領域，如何在成年動物神經系統(tǒng)中（缺少許多發(fā)育過程中的導向因子和支持的外部環(huán)境）正確導向再生的軸突回到原來的靶點仍然是一個難題。
而在2020年12月發(fā)表在 The FEBS Journal 的綜述文章中，周峰泉認為，楊輝論文中新產生的視網膜神經節(jié)細胞的軸突生長太快了，數量也太多了，他在論文中具體闡述道——
“在兩周內，楊輝研究新產生的視網膜神經節(jié)細胞的軸突就從外核層（ONL）一直長到中腦的上丘，每周生長7.5毫米，而大多數的軸突再生研究，四周后才達到視交叉，每周只長1毫米，且到了視交叉的大多數再生軸突都找不到目標腦核的路途；此外，在另外一項遵循細胞移植策略的研究中，在所有移植的具有高度再生能力的P0小鼠視網膜神經節(jié)細胞中，只有極少數能實現軸突再生，那些確實能延伸出軸突的，在視網膜神經節(jié)細胞層移植3周后，只有非常有限的視網膜神經節(jié)細胞把軸突延伸至了視網膜視神經的出口，離視交叉和上丘還差很遠?！?/span>
付向東則認為，楊輝的工作認為視神經可以以正常發(fā)育十倍的速度生長，“完全違背科學常識。”
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這些相互矛盾、甚至有反常識的現象如何解釋？膠質細胞到底是不是真的轉化成了神經元？
在考察了當前涌現的諸多神經原位再生的研究后，JCI文的兩位作者、周峰泉等業(yè)內不少專家都意識到，要排除假象，需要做更多的檢驗以完善證據鏈條。
首要面對的是 “泄漏” 的問題。
我們的大腦，比如視網膜，主要有兩類細胞，神經元和膠質細胞。這些實驗總的目標是把部分膠質細胞變成神經元，流行的方法是用病毒把某種工具包（包括啟動子）專一性的遞送到膠質細胞里進行干預（比如過表達或者敲除某個基因），為了跟蹤這些膠質細胞，工具包里也會帶熒光蛋白基因。這樣，原則上就可以看哪些膠質細胞真的變成了神經元。
但理想和現實存在差距，實際中，某些工具包的設計并不能保證僅僅對膠質細胞進行操作或標記。
”這個意思就是，你以為你設計的反應是應該百分百在膠質細胞里面進行的，但實際上不完全是，而且當你用的病毒滴度越高，這種反應越可能會在神經元里面進行，所以如果你使用了過量的病毒，就有可能直接在神經元里面看到原本應該在膠質細胞里表達的熒光蛋白，這樣你以為看到了轉變后的新神經元，但也許只是原來的神經元?！?陳功解釋說。
就泄漏而言，周峰泉認為，楊輝等人實驗中用的AAV病毒、GFAP啟動子，特異性都成問題。
“首先使用的AAV病毒本身就會感染視網膜內的不同種類細胞，包括神經節(jié)細胞（RGCs）和膠質細胞（如穆勒細胞）。同時，特異性針對穆勒膠質細胞進行基因編輯主要是通過使用GFAP膠質細胞特異性啟動子，但GFAP啟動子膠質細胞特異性并不是100%可靠。含GFAP啟動子的基因也可能在神經元細胞里表達?！?他說。
不過，陳功也提醒，泄漏的存在并不應該把膠質細胞轉分化為神經元的可能性徹底否定掉。
在具體實踐中，他的團隊和國際上許多其他團隊曾使用逆轉錄病毒來證明膠質細胞的轉分化，原因是逆轉錄病毒只會針對分裂型的膠質細胞，不會泄漏到不分裂的神經元里。他的團隊還運用膠質細胞譜系示蹤小鼠證明了事先標記示蹤的膠質細胞確實可以轉化為神經元。
“所以，一定要全面客觀地評價原位神經再生這一新技術，不能因為有人做錯了實驗就把整個領域一棍子打死。” 他說。
作為該領域的先行者，陳功也曾發(fā)表文章對一些評論進行了澄清。在他看來，AAV 雖然有泄漏現象，但是只要把滴度降的比較低，是可以把泄漏比例降的很低——
“我們通常推薦用1x108-10GC/ml的滴度把假陽性的比例降到5%或者更低。有些實驗室使用了過高量的AAV，比如超過1x1013GC/ml的滴度，這種高滴度所造成的假陽性值得關切。有些實驗結果需要第三方驗證?！?/span>
然而，奇怪的是，盡管楊輝的Cell論文使用的不同AAV都是1013的 “高” 滴度，竟然沒有觀察到任何的泄漏。
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另外一個說明確實發(fā)生了轉化的方法是證明中間態(tài)的存在。
試想一下，膠質細胞轉變成神經細胞不可能是瞬間發(fā)生的，一定經歷了某種中間過程和狀態(tài)——細胞的形態(tài)可能發(fā)生變化，細胞的位置正逐步遷移，細胞內部分子和功能也逐步變化。
而在之前的舉報信中，付向東曾指出楊輝Cell 論文缺乏轉變的中間狀態(tài)——
“楊輝的這篇《細胞》論文在4月份在線發(fā)表后，許多神經生物學領域的專家隨即對其數據的質量和可靠性提出了一系列質疑，指出論文并沒有確鑿的證據證明誘導新產生的神經元細胞所必經的細胞遷移、漸近的細胞形態(tài)和基因表達轉變以及新獲得的神經電生理特性等等。通俗地說，由于沒有細胞轉分化過程的系列實驗數據的支持，很難說他們的結論真實可靠，不能排除他們看到的陽性結果是出于實驗室常見的實驗假象?！?/span>
付向東認為，支持楊輝結論的大多數證據， 很有可能是由于GFAP-CRE在內源神經元中的泄漏表達所致。
那么，如何做才能讓人信服？
“就好像一個人坐電梯從10樓下到1樓，總要一層層下，不會一下子就跳到一樓了。我們團隊在小鼠和獼猴的大腦皮層里，都觀察到了星型膠質細胞向神經元轉化的中間態(tài)，也就是轉化早期的細胞既有部分膠質細胞的屬性又有神經元的部分屬性，這種中間態(tài)的存在是細胞之間轉分化的強有力的證據，” 陳功解釋說。
周峰泉也建議，應盡可能密集地捕捉轉變的中間狀態(tài)——
比如，視網膜中穆勒膠質細胞和視網膜神經節(jié)細胞分布在不同的層，轉變意味著，穆勒膠質細胞要一步步 “爬” 到目的地，且細胞形態(tài)和轉錄組要經歷逐步的變化（單細胞測序可以用于做這樣的分析）；最終，新轉變成的視網膜神經節(jié)細胞，需要進一步追蹤其軸突生長，準確的投射到相應的腦區(qū)并發(fā)揮正常功能（當前腦組織清洗和深度3D影像技術都可以做這樣的觀察）。
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質疑和批評是科學的常態(tài)，也是進步的源泉，尤其是在面對紛繁復雜的新興領域的時候。很多時候，區(qū)分事實和假象并不容易，但“如實報告”是應有的基本規(guī)范和底線。
盡管有各種可供批評之處，不少研究都聲稱緩解或者治療了動物模型的某種神經疾病。顯然，基礎研究的結果越可靠，就越有利于后期的臨床轉化。楊輝等人報道的 “誘人” 結果，無論是治療神經性眼盲還是帕金森，引發(fā)更大范圍的關注自然也不奇怪，如果是一項不重要的結果，也很少會有人爭搶。
同樣也面臨JCI一文質疑的張康向《知識分子》表示，“選擇四月齡甚至更大的rd10小鼠，已經檢測不到感光細胞和視網膜電圖信號，再結合GFAP-CRE追蹤系統(tǒng)，我們認為后形成的感光細胞和功能由穆勒膠質細胞轉化而來”。
他也同時承認，后期需要完善體內追蹤系統(tǒng)，包括使用更長或全長GFAP啟動子、double cre，設置嚴格的對照組，足夠密集的取樣時間點和全面的分析手段，逐級追蹤穆勒膠質細胞向神經細胞的轉化過程，對形成的細胞進行全面的分析，以證明所看到的神經細胞真的由穆勒膠質細胞而來。
付向東就此也向《知識分子》表示，對于JCI文質疑，他們正設計實驗全面解決AAV泄漏的問題。
截止發(fā)稿時，楊輝沒有回應《知識分子》的電郵詢問。
“我相信如此拉風的研究一定會有人重復，只有重復才能做出最終的判斷。” 陳功說。
