生物多樣性：免疫球蛋白 | 饒毅講課
撰文 | 饒毅
多樣性與自然選擇是生物演化的核心規(guī)律。
多樣性與選擇也是免疫學的核心概念之一。
免疫學的發(fā)展，不僅帶來了對基本原理的理解，在分子水平揭示了美妙的自然規(guī)律，而且建立了對生物學研究和醫(yī)學實踐有用的技術，改善了人類的健康、推動了人類的進步。
免疫與危害動植物的感染密切相關。動植物識別和排除抗原性異物，應對外界病原菌、污染物和體內(nèi)疾病等，參與監(jiān)控清除自身變異成分（腫瘤、衰老和死亡細胞）。免疫分為先天性免疫和獲得性免疫。先天性免疫又稱非特異性免疫（innate immunity或nonspecific immunity）是在長期進化過程中形成，并具有遺傳特性，生來具有的功能免疫；獲得性免疫又稱特異性免疫（acquired immunity or specific immunity），是后天感染抗原性異物，或人工接種物（如疫苗和異物等）而使機體獲得，針對病原體的抵抗能力。哺乳類動物中有特異的淋巴細胞分別介導體液免疫和細胞免疫。體液免疫的B淋巴細胞產(chǎn)生抗原相對應的抗體，來達到保護生物體的免疫機制。面對自然界如此繁多的抗原性物質(zhì)，個體生物可以產(chǎn)生直接與抗原結合，多于1011種類的蛋白抗體分子，被稱之為抗體的多樣性。
免疫學研究源于人類希望抵抗傳染病，也與人類對輸血的實際需求有關。經(jīng)過迷信、迷惑、試錯等多個階段，步履艱難、甚至犯過錯誤，堅持探索的嚴肅研究者逐漸從現(xiàn)象到本質(zhì)，到1898年確定：抵抗傳染病和輸血涉及相同的核心問題——免疫。對免疫的機理，從1900年誕生側鏈學說后不斷修改，1957年出現(xiàn)克隆選擇學說，1960年代理解抗體蛋白質(zhì)的結構，1970年代理解編碼抗體的DNA有特殊的重組機制逐步解析抗體多樣性產(chǎn)生的機理。
天花的預防
在兩千五百年前，古希臘歷史學家Thucydides（460-400 BC）記錄了雅典的傳染病，患病痊愈者一般不再發(fā)病、如果發(fā)病也輕于初發(fā)者。基督教曾把這種差別歸因于上帝，把第一次就不生病者（我們今天知道是天然免疫者）認為是無罪者，而患病痊愈者（后天免疫者）當成洗清了罪惡。在歐洲所謂中世紀的階段，阿拉伯世界和伊斯蘭地區(qū)的科學發(fā)展，改變了人類對傳染病和免疫的宗教和迷信看法。
天花（variola, small pox）可能有上萬年的歷史（Riedel，2005）：在公元前一千年前的埃及木乃伊上留下了天花的痕跡，中國也在公元前1122年就有天花的記載，歐洲在5世紀到7世紀間開始有天花。天花曾肆虐世界，死亡率高、不死也留下失明或臉上疤痕等后遺癥。18世紀歐洲天花感染率非常高，接近全部群居人口，占兒童死亡率的三分之一。
人們很早知道已患過天花的人不會再患天花。在世界上多個地區(qū)曾出現(xiàn)用天花病人的少量液體接種給健康人，使后者獲得免疫力。這一方法也有人告訴歐洲，但未獲推廣。英國駐奧斯曼帝國大使蒙太古夫人（Mary Wortley Montague，1689-1762）于1717年在伊斯坦布爾根據(jù)當?shù)亓鱾鞯姆椒?，請使館醫(yī)生Charles Maitland（1668-1748）監(jiān)督給自己兒子接種少量天花（Downie，1951）。她們回英國后，她請Maitland再給女兒接種，Maitland要求有六個醫(yī)生在場。成功后，其中一位醫(yī)生要求給自己的兒子接種。英國還用犯人和孤兒做過試驗，讓皇后放心后，她再要求給王子接種，這樣逐漸傳開。接種少量天花既可能有效，也可能導致天花發(fā)病。
1774年，英國農(nóng)民Benjamin Jesty（1737-1816）用擠奶女工的牛痘接種于其妻子和兩個兒子，成功地避免了他們患天花（Pead，2003），但他沒發(fā)表文章。鄉(xiāng)村醫(yī)生Edward Jenner（1749-1823）有相當?shù)目茖W基礎，1787年確定杜鵑的行為而于1789年入選皇家學會。1796年5月14日，他從擠奶女工Sarah Nelmes手上取得牛痘接種給8歲的男孩James Phipps（1788-1853），六周后接種少量天花，Phipps完全不被感染，證明牛痘誘導免疫的成功。Jenner并非第一位接種牛痘者，但他第一位正式報道牛痘接種的方法。1798年，Jenner總結了自己接種病例以及通過訪問得到的一些回顧性病例，共23例發(fā)表專著（Jenner，1798），1799再加例子，到1801年英國有逾六百例（Jenner，1801）。Jenner還區(qū)分了真的牛痘和假的牛痘，從假牛痘獲得的材料不能有效地引起對天花的免疫，真牛痘才能保證成功地誘發(fā)免疫。Jenner稱牛痘為Variolae vaccinae（牛的天花），用牛痘接種導致人對人的天花免疫就被稱為vaccine。Jenner當時有一個錯誤，認為牛的天花來自馬的炎癥，但他對牛痘接種的方法做出了不可磨滅的貢獻。
免疫學的發(fā)展與微生物學相關。十九世紀，法國化學家巴斯德（Louis Pasteur, 1822-1895）和德國醫(yī)生科霍（Robert Koch，1843-1910）為代表的科學家們證明傳染病的病原菌學說，建立培養(yǎng)細菌的方法，發(fā)現(xiàn)重要的致病菌，發(fā)明多種傳染病的疫苗（炭疽病和雞霍亂疫苗等）（Pasteur, 1881），推動了免疫學的發(fā)展。巴斯德把原來詞根為牛的vaccine推廣為廣義的疫苗（Baxby，1999）。
接種疫苗后，人獲得免疫力的原理是什么？巴斯德曾認為是第一次感染過程中細菌耗盡了體內(nèi)對細菌生長需要的營養(yǎng)成分，所以細菌不能再感染同一個人，該個體從而產(chǎn)生免疫力。
抗血清的發(fā)現(xiàn)
先天免疫的發(fā)現(xiàn)歸功于俄國科學家élie Metchnikoff（1845-1916）在俄國和法國進行的研究。Metchnikoff最早在其比較病理學研究中發(fā)現(xiàn)吞噬細胞的作用（Metchnikoff，1884，1901,1905; Tauber, 2003）。
體液免疫研究源于德國。1888年，法國細菌學家Emile Roux（1853-1933）和旅法瑞士細菌學家Alexandre Yersin（1863-1943）發(fā)現(xiàn)白喉毒素是白喉桿菌致病的原因。1889年Koch實驗室的北里柴三郎（Shibasaburo Kitasato，1853-1931）發(fā)現(xiàn)破傷風毒素是破傷風桿菌致病的原因。毒素研究風靡一時的情況下， Koch曾誤認為結核菌素（tuberculin）是結核桿菌治病的原因。
1890年，Koch研究所的Emil Adolf Behring（1854-1917）和北里柴三郎發(fā)表“動物對白喉和破傷風免疫的機理”一文，報道了白喉毒素的抗毒素和破傷風毒素的抗毒素（Behring and Kitasato，1890），證明在不含細胞的血清中有免疫作用的物質(zhì)。Behring主要做白喉、北里做破傷風的抗毒素，他們獲得的抗血清既能治療已感染的動物，也能預防健康動物被感染。在Behring和北里之前，除了細胞免疫之外，免疫的原因認為是因為血液有殺菌能力、或動物適應了毒素、或動物在接種后發(fā)生了化學變化使其體液和組織不利于微生物生長。Behring用大鼠進行的白喉研究不支持以上解釋，而提出免疫后動物的血液可以中和白喉毒素，這一結論在北里的破傷風毒素研究得到進一步支持和推廣。
Behring和北里報道的破傷風實驗既用過破傷風桿菌、也用過破傷風毒素作為免疫原，用低于導致疾病的劑量注射給兔，誘發(fā)兔的免疫，被注射后的兔對再感染或破傷風毒素有20倍的抵抗力。從有免疫力的兔的頸動脈獲取血，注射給小鼠的腹腔，得到的兩只小鼠與未被免疫兔血注射的兩只小鼠比較。后者在破傷風桿菌注射后分別于20小時、36小時死亡，而免疫兔血注射過的小鼠健康生存。如果免疫的兔血凝結，其上清也就是血清。以免疫的兔血清注射6只小鼠的腹腔，24小時后他們再被破傷風桿菌感染不會生病，而對照小鼠48小時死亡。以上實驗顯示免疫的血清可以讓正常動物對感染的抵抗力增加，有預防作用。他們還將抗血清與可以感染小鼠的破傷風桿菌同時注射的動物，也提高后者的生存。他們認為這是治療作用。一旦獲得抗血清，無論預防式、還是治療式，小鼠長期免疫。作為對照，非免疫的兔血清，沒有這些作用。他們不僅用了兔，還用過牛、馬和羊。
Behring和北里的文章清晰地表明血清中含有對抗毒素的物質(zhì)：破傷風免疫后的兔血可以中和破傷風毒素；這一作用存在于無細胞的血清中；將免疫動物的血清轉入其他動物可以繼續(xù)發(fā)揮作用；未經(jīng)免疫的動物不具有消滅破傷風毒素的能力（Behring and Kitasato，1890）。這篇文章開創(chuàng)了體液免疫。
一周后在同一刊物，Behring單獨發(fā)表了有關動物對白喉免疫力的論文（Behring，1890），補充第一篇文章的破傷風毒素。他顯示動物的血液也可以產(chǎn)生對白喉毒素的免疫力。Behring單獨的這篇文章未用抗血清一詞，不如兩人合作的抗破傷風毒素的文章。
當時也在Koch研究所工作的Paul Ehrlich（1854-1919）也研究了抗毒素。Ehrlich發(fā)現(xiàn)了兩種植物蛋白質(zhì)（蓖麻毒素（ricin）和相思子毒素（abrin））的抗毒素（Ehrlich，1891b）。他先給鼠低劑量的蓖麻毒素，逐漸增加劑量，前五天沒有變化，第六天鼠對蓖麻毒素的耐受力大大提高（蓖麻毒素的致死劑量提高到最初的13倍），其后可以逐漸增加，但不能超過1000倍。主動免疫延續(xù)的時間長于6個月。與白喉和破傷風抗毒素一樣，產(chǎn)生了抗毒素的動物之血液可以輸給其他的動物而使之產(chǎn)生被動免疫。被動免疫時間遠短于主動免疫，但他沒有確定具體時間。同樣，他發(fā)現(xiàn)相思子毒素可以誘導免疫。兩種免疫都是特異的，沒有交叉，他提出不同毒素誘導的抗體是不同的。1892年，Ehrlich發(fā)表“免疫的遺傳和吮乳”一文，揭示新生鼠含母親來源的抗體，提示抗體可以傳過胎盤到達胎兒，而出生后的嬰兒還可以通過母乳再得到抗體，嬰兒的消化道不同于成人，沒有破壞抗體，而可以吸收抗體進血液（Ehrlich，1892）。
因為效率不高、變異較大，Behring的抗白喉血清產(chǎn)量不穩(wěn)定，用其方法的工廠（Hoechst）難以獲得高效價的抗血清。Ehrlich的抗蓖麻毒素抗血清和抗相思子毒素抗血清有較高效價，而且Ehrlich檢測方法的定量化較好。在Behring邀請、Koch支持下， Ehrlich于1892年加入改進抗白喉抗血清和抗破傷風抗血清的生產(chǎn)。1894年Ehrlich等發(fā)表了“白喉抗血清的生產(chǎn)和應用”（Ehrlich，Kossel，Wassermann，1894）。他們的改進包括：用山羊（和牛）產(chǎn)生抗體；通過先用低劑量后增加劑量獲得高效價抗體；用標準制備的毒素在體外檢測抗血清中和毒素的比率，檢測抗血清的效價（“免疫單位”）。他們制備的抗血清很穩(wěn)定，臨床治療效果很好。他們還發(fā)現(xiàn)可以用山羊的乳汁獲得抗體，也有效果。血清含量是乳汁的20倍左右，但一天可獲30升乳汁，相當于約1.5升的血。
1896年，普魯士教育部長請Ehrlich建立“血清研究和檢測研究所”。Ehrlich費很大精力標準化白喉抗血清的檢測方法。Ehrlich首先將毒素和抗毒素的作用視為化分子之間的相互作用（Ehrlich，1885，1897）：一個毒素分子與特定的不可改變量的抗體相結合（Ehrlich， 1897）。Ehrlich稱抗血清中起作用的分子為抗體（antik?rper，antibody）（Ehrlich，1897）。
對傳染病的預防和治療需求是人類開始免疫學的一條主線。另一條是對輸血的需求。
輸血：愿望和困境
有關血液，人類流傳很多不同看法、不乏浮想聯(lián)翩。所謂血型與性格的關系，長期流傳而缺乏證據(jù)。所謂放血療法，歷史上常有人推廣而缺乏有效性的證據(jù)。
十九世紀，人類理解血液由細胞和血清兩部分組成。血清中含多種分子。紅細胞運輸氧氣，白細胞有粒細胞（中性、嗜酸性、嗜堿性粒細胞）、吞噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞等多種起防衛(wèi)機體的作用（Ehrlich，1878；Ehrlich，1891a；Ehrlich and Lazarus,1898），血小板通過凝結起封閉破裂血管的作用。缺血、或缺乏血液的特定成分可導致人類疾病。
人類從很早開始希望輸血、或補充血液中特定成分，但不同時期遇到不同的實際困難。在不懂免疫學之前，輸血有很大危險。1901年，ABO血型的發(fā)現(xiàn)根本地改變了輸血的安全性，在第一次世界大戰(zhàn)開始成規(guī)模應用，現(xiàn)在全世界幾萬所醫(yī)院每年進行數(shù)以百萬至千萬次輸血，挽救了無數(shù)人的生命。
有爭議的傳說教皇無辜八世（Pope Innocent VIII, 原名Giovanni Battista Cybo，1432-1492）半昏迷后，醫(yī)生曾安排他與三位十歲的男孩換血，四人都去世。1656年，英國建筑家、科學家Christopher Wren（1632-1723）給狗注射過紅酒和啤酒（Maluf, 1954），1663年他和Robert Boyle（1627-1691）給狗進行靜脈注射，雖然他們注射的是諸如酒和鴉片，也奠定了輸血的基本技術（Learoyd，2012a）。1665年2月，英國醫(yī)生Richard Lower（1631-1691）在兩只狗之間輸血（Lower，1666a，1666b；Maluf, 1954）。1667年6月15日，法國路易十四的御醫(yī)Jean-Baptise Denys（1643-1704）把12盎司的羊血輸給15歲的男孩，第二例是輸給勞工，兩人都活下來了。第三例是瑞典男爵Gustaf Bonde（1620-1667），在接受第二次羊血后去世。
當時并不知道血液的功能，一方面氧氣尚未發(fā)現(xiàn)，另一方面還相信血與性格的關系。1667年11月23日， Lower和Edmund King（1630-1709）在皇家學會將羊血輸給Arthur Coga（Lower and King，1667），目的是為了改善其頭腦“太熱”，所以用溫順動物（綿羊）的血（Maluf，1954）。法國Denys醫(yī)生用的第四例是經(jīng)常離家出走的瘋子Antoine Mauroy，其主人和妻子先后要求Denys輸小牛的血改變他，后來死亡（Maluf，1954）。這些做法以后當然被質(zhì)疑。
輸血的安全性明顯有問題，法國、英國、教皇都禁止輸血近150年。在不懂血液功能、不懂消毒、不懂免疫的多重無知的情況下，輸血必定難以成功。
雖然十八世紀還有各種傳聞和不完備的記載，包括Eramus Darwin（1731-1802）曾設計過輸血的儀器，它不是輸血的熱門時期。但十八世紀的科學奠定了輸血的基本知識。英國的Joseph Priestley（1733-1804）和法國的Antoine Lavoisier（1743-1794）發(fā)現(xiàn)氧氣及其功能，以后才能理解血液給全身輸送氧氣的作用。從1242年阿拉伯學者Ibn al-Nafis（1213-1288）到1628年英國的William Harvey（1578-1657），人類終于理解了血液循環(huán)，明確心臟與血流的關系、血流的方向（Harvey，1628），澄清此前認為血液無方向彌散全身等錯誤觀點。
十九世紀，英國婦產(chǎn)科醫(yī)生James Blundell（1790-1878）進行了第一次有確切記載的人與人之間輸血。鑒于產(chǎn)后出血常常導致死亡的危害，他提出輸血有益。1818年，他先用動物做實驗，讓狗放血后，再注射來自動物的血液。他證明不同種動物之間輸血導致死亡（但在狗的血完全放完后，輸入羊血，狗可以恢復好幾天之后再死亡）（Blundell，1818）。他也發(fā)現(xiàn)血液不能在體外保存太長時間（低于30秒）。他還證明給動物輸來源于其自體的血是安全的，而且血液通過他發(fā)明的儀器重新回到動物體內(nèi)是安全的。他實驗了輸血過程需要防止混入氣泡導致的血管阻塞。1818年12月22日，在其他醫(yī)生要求下，他給一位瀕臨死亡的胃癌患者輸了來自幾位自愿者的血，狀態(tài)有好轉后兩天還是去世了（Blundell，1819）。1818年至1825年，他試過6例輸血，都不成功。1825年，他與Charles Waller (1802-1862)和Edward Doubleday（1799-1882）成功地給產(chǎn)后失血昏迷的婦女進行輸血，并挽救她們的生命，其中第一例的血來自患者的丈夫，有些來自醫(yī)護人員（Doubleday, 1825; Waller, 1825; Dzik, 2018）。他還發(fā)明和比較了幾種輸血儀器（Blundell，1824，1829b）。輸血危險性和不確定性仍然很明顯。
1869年，德國哥廷根大學生理研究所的醫(yī)學生Adolf Creite（1847-1921）發(fā)表他的觀察和實驗結果。在法國Claude Bernard（1859）發(fā)現(xiàn)狗血清注射到兔導致兔出現(xiàn)血尿的基礎上，Creite給兔分別注射約8毫升的小牛、豬、狗、羊、貓、雞、鴨、或山羊血清，接受其中后5種血清注射后，兔的尿中出現(xiàn)血、生病、死亡。他猜想是血清所含蛋白質(zhì)導致兔的血尿。他進一步實驗，加熱處理血清，出現(xiàn)的蛋白質(zhì)凝聚物被過濾之后，再注射給兔，就不會有血尿和死亡。因此，他提出血清蛋白質(zhì)導致接受輸血的動物紅細胞溶解。體內(nèi)實驗后，他還進行了體外實驗，將兔血與其他動物的血清混合，發(fā)現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象。他在體外也觀察到了紅細胞溶解、但對其重要性不甚明確（Creite，1869；Hughes-Jones and Gardner，2002）。
德國病理學家Emile Ponfick（1844-1913）于1874年向波羅的海醫(yī)生協(xié)會報告：一位34歲婦女死于輸羊血，他稱病理解剖發(fā)現(xiàn)其血含溶解的紅細胞。1875年，Ponfick通過羊對狗輸血證明羊的紅細胞溶解、尿液含血紅蛋白（血紅蛋白尿），他進一步證明狗的血紅蛋白尿來自羊，因為如果只注射羊的血清、而不是全血，狗就不會有血紅蛋白尿（Ponfick，1875）。
1875年，德國生理學家Leonard Landois（1837-1902）出版了358頁的專著《輸血》，總結了1667年至1874年的478例輸血。其中129例輸動物血給人，原作者號稱42例后患者有所改善，62例沒有改善，25例暫時改善但不可靠。347例人對人輸血，150例“改善”，180例不佳，12例不明，3例結果未知，2例在輸血過程中去世（Landois，1875；Maluf，1954）。他在體外顯微鏡研究八種動物血清對其他動物紅細胞的作用，觀察到一種的動物血清導致另一種動物紅細胞溶血和凝集作用（Landois，1875；Hughes-Jones and Gardner，2002）。
1894年，在Koch研究所工作的Richard Pfeiffer （1858-1945）發(fā)現(xiàn)“Pfeiffer現(xiàn)象”：將霍亂弧菌注射到對霍亂有免疫力的豚鼠或兔的腹腔，霍亂弧菌會變形然后溶解；如果將霍亂弧菌與少量對霍亂免疫的血清注射到對霍亂沒有免疫力動物的腹腔，霍亂弧菌也會被溶解（bacteriolysis）（Pfeiffer，1894）。當時Pfeiffer認為這種現(xiàn)象只能在動物體內(nèi)發(fā)生，而在法國巴斯德研究所的Metchnikoff證明在體外也一樣發(fā)生（Metchnikoff，1895）。1895年，在Metchnikoff實驗室工作的比利時科學家Jules Bordet（1870-1961）發(fā)現(xiàn)霍亂弧菌在抗血清作用下出現(xiàn)凝集現(xiàn)象（Bordet，1895）。維也納大學的Max von Gruber（1853-1927）發(fā)現(xiàn)抗血清對霍亂和傷寒桿菌的凝集作用（Gruber and Durham，1896）。
1898年， Bordet在體外觀察到一種動物血清一般都能導致另外一種動物的紅細胞凝集，例如雞血清可凝集大鼠和兔的紅細胞。異種動物血清也可以溶解紅細胞（如兔血清溶解豚鼠紅細胞），導致其內(nèi)含血紅蛋白外泄。55oC加熱處理血清可以滅活其溶血作用，但不影響其凝集作用。血清對紅細胞的溶血和凝集作用，與血清對細菌的作用很像，而且這兩種作用依賴的血清內(nèi)物質(zhì)對熱的敏感也類似，所以Bordet提出血清中影響紅細胞的物質(zhì)與血清中對抗細菌（如霍亂菌）的物質(zhì)類似。因此，Bordet的研究不僅明確血清對紅細胞的兩種作用，而且提出血清抗異種動物紅細胞的機理類似于血清抗病原菌的機理（Bordet，1898，1899）。
Bordet的概念很快被接受。
Ehrlich指出：“很可能溶血的機理與溶菌的機理非常相似。因此溶血的研究就有相當?shù)睦碚撘饬x”（Ehrlich and Morgenroth，1899）。而且Ehrlich與Julius Morgenroth（1871-1924）合作研究溶血，在1899年和1900年發(fā)表六篇“溶血”的研究論文（如：Ehrlich and Morgenroth，1899，1900a，1900b）。
從古代將輸血作為一個特殊問題，到19世紀末科學家終于確定輸血問題也是免疫問題。
血型：突破
因為Creite（1869）發(fā)現(xiàn)體外可以觀察血清導致紅細胞溶解和凝集、Landois（1875）進一步使用體外紅細胞凝集和溶解的方法，實質(zhì)上建立了體外血型檢驗的方法學。Bordet（1898，1899）提出血清對細菌和紅細胞的作用類似而將紅細胞的血型分析明確納入免疫學。
也就是說，十九世紀末，已經(jīng)出現(xiàn)大部分有關輸血的技術和科學基礎，但缺一關鍵：血型及其匹配。也是一種“萬事俱備，只欠東風”。
1900和1901年，奧地利維也納大學病理解剖研究所的Karl Landsteiner（1868-1943）發(fā)現(xiàn)了人類的血型。檢測血型的方法非常簡便而實用。今天我們知道有26種主要血型，至少270種不同紅細胞表型，Landsteiner發(fā)現(xiàn)了對輸血影響最大的ABO血型和Rh血型。
既然之前無人知道血型，Landsteiner不可能是為了發(fā)現(xiàn)血型而研究血液，而且他也不是為了輸血而研究血型。1900年，他先用動物研究胰蛋白酶形成抗體，希望通過抗體來研究當時化學不能區(qū)分的蛋白質(zhì)差異，他也研究了牛血清對豚鼠紅細胞的沉淀和凝集作用。他用碳酸或硫酸銨沉淀牛血清，將血清分成被碳酸所沉淀出來的球蛋白部分和其他部分。將溶液的氯化鈉濃度調(diào)到0.6%之后，可以溶解球蛋白。Landsteiner用豚鼠紅細胞來比較牛血清的球蛋白部分和非球蛋白部分的凝集作用，發(fā)現(xiàn)球蛋白作用強于其他部分。他也比較了球蛋白部分和非球蛋白部分對紅細胞的溶解作用，發(fā)現(xiàn)兩者沒有差別。在此過程中，他有其他觀察，他加在論文的注腳中：“健康人的血液可以凝集動物的紅細胞，而且不同人的血液也可以凝集其他人的紅細胞。不清楚這樣現(xiàn)象是否源于個體差異、還是損失或細菌感染影響。重病人的血清這一現(xiàn)象更明顯。這一現(xiàn)象也許與1892年Maragliano發(fā)現(xiàn)的血清可以溶解多種疾病患者紅細胞的現(xiàn)象有關”（Landsteiner，1900）。
1900年的注腳成為1901年研究的起點（Landsteiner，1901）。Landsteiner首先澄清自己的研究與Maragliano（1892）不同，最大的差別在于Maragliano觀察到的溶血在同一個人的體內(nèi)發(fā)生，可能與疾病有關，而Landsteiner發(fā)現(xiàn)的紅細胞凝集和溶血只在不同個體的人之間發(fā)生。按Ehrlich and Morgenroth（1900a）的定義，Landsteiner指出自己研究的也是同種異體的凝集素和溶血素（isoagglutinins和isolysins）。他用三張表列出了做體外凝集實驗的結果，含6位成年男性之間、6位產(chǎn)后女性之間、5位產(chǎn)后女性和6個胎盤的紅細胞之間的結果，另外還做了10位成人，其結果與表格顯示的一致。
表一可見，Sturli和Landsteiner本人（L）的紅細胞不會被其他五位的血清所凝集；Pletsching和Z兩位互相不凝集，也不凝集Sturli和L，但凝集Sturli和E；Sturli和E也互相不凝集，不凝集Sturli和L，但凝集Pletsching和Z。所以六位成年男性按紅細胞凝集情況可以分成三組。
表二可見，六位產(chǎn)后女性也分成三組：Linsm不與其他五位發(fā)生凝集；Seil、Mittelb和Tomsch三位互相不凝集，也不凝集Linsm，但凝集Lust和Graupn；Lust和Graupn也互相不凝集，不凝集Linsm，但凝集Seil、Mittelb和Tomsch。
表三可見，產(chǎn)后女性的血清與胎盤的紅細胞在凝集反應中，就不如以上這么簡單。Landsteiner提出以前Halban就發(fā)現(xiàn)嬰兒血清在凝集反應也常常陰性。Josef Halban（1870-1937）是維也納大學的婦產(chǎn)科醫(yī)生，他讀過1900年Landsteiner文章的注腳后，用產(chǎn)婦和嬰兒的血做過凝集實驗（Halban，1900）。
Landsteiner提出不考慮胎盤的紅細胞結果，可以看到成人血清和紅細胞的凝集反應呈三類：A、B、C。他將對其他不起反應的稱為C，另外兩類為A和B。當時所謂的C型，他后來改稱O型。他沒有交叉檢測六位男性和六位女性，所以并不確切知道男性的三類與女性的三類是否相同。他用的人數(shù)太少，所以沒有發(fā)現(xiàn)AB型。
文章結尾指出：“最后，不妨提到這些觀察可能協(xié)助解釋治療性輸血的各種后果”。
Landsteiner（1901）的研究相當簡單，但意義重大。基本技術非他發(fā)明，他是應用已有技術，但他有想法。實驗的操作也很簡單，不需要實驗高手。實驗需要的時間也很短，一周做幾十人恐怕很容易，一天做幾十人也并非難事。說明：在生物學，有時候，想法也比技術、手段、努力要更重要。
當時為什么沒有其他人用同樣方法研究血型？在他之前，已知不同個人之間輸血有問題，在一定程度上等于已經(jīng)用輸血來體內(nèi)檢測個體差異，但沒有科學家用體外實驗檢驗不同個體來源的血清和紅細胞之間的反應。與Landsteiner研究最接近的是回到比利時的Bordet以及德國的Ehrlich和Morgenroth。Bordet在Landsteiner之前已經(jīng)做了很多體外血清和紅細胞的溶解和凝集反應，而Ehrlich和Morgenroth接連發(fā)表了六篇體外血清和紅細胞的溶解和凝集反應，每一篇都比Landsteiner（1901）的長。Ehrlich和Morgenroth當時集中探尋免疫的規(guī)律，特別是“側鏈學說”，可能忽視了從實驗設計和操作上都更容易解決的血型分析和匹配問題。在知道Landsteiner（1901）結果后，Ehrlich持反對態(tài)度：人為什么有個體間的免疫反應？其他人不是病原菌，一個人用不著通過免疫系統(tǒng)對付其他人。這個問題當然不是Landsteiner帶來的，因為早就知道人對人輸血經(jīng)常不成功，雖然以前可有多種如操作不當、血液保存不妥等其他非免疫的原因，但到了1900年，應該可以提出個體間的差異導致的免疫反應是輸血困難的原因之一。但是，Ehrlich問題的簡化版：為什么一個人在生理上要有機制破壞另一人的紅細胞？兩個人的血從來不見面，自然界設計這種機理豈非多此一舉？這種問題確實不好回答，其答案的提示在Landsteiner的表3（雖然當時他自己也不知道表3的意義）和本章的第6節(jié)（免疫耐受），問題需要反過來思考：為什么一個人的免疫系統(tǒng)不攻擊自己，只攻擊其他？
1900年Landsteiner的課題并非血清與紅細胞的關系，他最初試圖用血清來檢測蛋白質(zhì)的特征（包括來自不同動物種屬的同一蛋白質(zhì)的差別）。他在1900年的注腳，燃起了自己的興趣，很快用簡單的實驗揭示了血型的規(guī)律，而且立即提供了可以用于臨床實踐的方法。但他那時研究并不如Bordet、Ehrlich、Morgenroth等。他的研究核心在想法，而實驗方法是已有的，而且很簡單。他只研究了二十幾個人，結論主要依賴12人。表1的六位成年男性屬于三類血型（兩位O型、兩位A型、兩位B型），表2的六成年位女性也屬于三類（一位O型、三位A型、兩位B型）。這種數(shù)據(jù)在統(tǒng)計上也不典型。當然他說還做了10位，結果與此類似。但應該做幾十例、上百例，才能確定大概多少類。因為實驗的簡便性，只能推測他實驗設計有欠缺，而沒有花一、兩個月的時間做幾百例。
血型：從基礎回應用
Landsteiner的樣本量太少，只發(fā)現(xiàn)了ABO 血型的A、B和O。1902年，他的學生Adriano Sturli（1873-1964）與維也納大學第二醫(yī)學診所的實習醫(yī)生Alfred von Decastello（1872-1960）合作研究了155人（121位病人、34位常人），他們發(fā)現(xiàn)其中4人很特別，他們的血清和紅細胞不互相凝集，其中任意一位的血清不凝集其他154人的紅細胞，但他們的紅細胞被所有這151人的血清所凝集（Decastello and Sturli，1872-1960）。Decastello和Sturli當時把這4人稱為沒有特別的型（no particular type）。后人將AB血型的發(fā)現(xiàn)歸功于他們，因為這4位應該是AB血型。他們還發(fā)現(xiàn)凝集素不會被疾病所改變，驗證了6個月內(nèi)的新生兒的沒有血型反應，這樣完成了ABO血型的發(fā)現(xiàn)。
美國醫(yī)生Reuben Ottenberg (1882-1959) 從五個家庭的樣本注意到同一家的血型相似性更高 (Epstein and Ottenberg，1908)。在德國海德堡實驗癌癥研究所工作的醫(yī)生Emil von Dungern（1867-1961）和波蘭科學家Ludwig Hirszfeld（1884-1954）分析了72家的348人 (一般為兩代)，證明血型符合孟德爾遺傳規(guī)律(von Dungern and Hirszfeld，1910)。von Dungern 和Hirszfeld指出，對血型來說，雖然血清所含抗體很重要，細胞的抗原也很重要。他們提出A和B獨立遺傳，它們?yōu)閮蓚€獨立遺傳的基因、分別有兩個等位基因（A和a，B和b），A和B共顯性而它們都對O型顯性。德國猶太數(shù)學家Felix Bernstein（1878-1956）指出ABO血型由一個基因決定，A、B和O是同一個基因的三種等位基因，孩子從父母遺傳有六種可能性基因型（A/A，A/O，B/B，B/O，A/B和O/O）和四種表型（A，B，AB，O）（Bernstein，1924）。
ABO血型的確定，應用意義很大，可能遠大于其在免疫學的基礎意義?？梢酝ㄟ^事先體外試驗匹配血型，大大地提高輸血的安全。按紅細胞表達抗原的情況，ABO血型有四類：表達A抗原的紅細胞，表達B抗原的紅細胞，表達A抗原和B抗原的紅細胞，既不表達A、也不表達B的O型紅細胞。O型的紅細胞不會被其他血型的血清所破壞，AB型的紅細胞會被其他三種血型的血清所含的抗A、抗B抗體所識別引起破壞，A型的紅細胞會被B型或O型血清所含抗A抗體十倍引起破壞、但不會被AB或A型血所破壞，B型紅細胞會被A型或O型血清所含抗B抗體而引起破壞、但不會被AB或B型血所破壞。
早期還需要克服醫(yī)生不用配血型，而直接用需要血液的患者作為檢測指標的辦法：先給需要血液的患者慢速少量輸血，問問其反應，如果可以就多輸，不行就停止。這種生物鑒定有一定的作用，但不可靠。
在多方推動下，體外配血型成為標準步驟。在有了臨床簡便可靠的檢測血型方法（Ottenberg，1911）、有了用檸檬酸抗凝血的辦法（Lewinsohn，1915）而可以在體外長期保持血液之后，血庫才成為可能，大規(guī)模輸血得以推行。
免疫的“我”v“它”：免疫耐受
區(qū)分自我與非我，這一重要哲學問題的答案只能來自神經(jīng)生物學。
區(qū)分自我與非我也是免疫學的重要問題之一。免疫系統(tǒng)如果不能區(qū)分我與它，就會出現(xiàn)紊亂：免疫系統(tǒng)對自己進行攻擊，是自身免疫疾病。免疫系統(tǒng)如果不能有效地發(fā)現(xiàn)有害的異己，是免疫缺陷，容易感染疾病。這些異己既包括外界入侵的病原微生物，也包括體內(nèi)的變化，如癌細胞。
對免疫系統(tǒng)來說，什么是自我? 什么是異己?如何解決這一問題?
1916年，芝加哥大學的Frank Lillie（1870-1941）發(fā)現(xiàn)雙生子在胚胎期有血液連通。如果雙生子一雄、一雌，雌性出生長大后會出現(xiàn)不育現(xiàn)象，因為胎兒期間血液連通導致雄性的雄激素由血液進入雌性胎兒，后者受雄激素影響，以后不能生育，這種母牛稱為freemartin，造成農(nóng)民的損失，如果早期發(fā)現(xiàn)，可以不養(yǎng)大這種以后不能生育的牛。
Lillie對這一現(xiàn)象的解釋，引起農(nóng)民的孩子Ray Owen（1915-2014）讀研究生之后進行了實驗：如果雙生的牛在胚胎時期血液連通，那么對免疫是否有影響。1945年，在美國威斯康辛大學的Owen發(fā)表了80對牛雙生子的血液抗原性的研究結果。他檢測了80對雙生牛的四十多種血液抗原，發(fā)現(xiàn)大部分雙生牛的血液抗原完全一樣（Owen，1945）。他推測不可能是因為它們都是基因幾乎完全相同的同卵雙生，因為：1）已知牛雙生子同卵雙生低于異卵雙生的幾率；2）雙生牛長大后，其中一只不能完全將自己的抗原傳給后代，反過來說明它本身的抗原性并非都是遺傳因素造成；3）在罕見的來自不同父親、同一母親的兩只雙生牛的情況下，它們還是抗原完全相同，這不可能是遺傳所致；4）Owen發(fā)現(xiàn)部分雙生牛出生后含兩種不同的紅細胞。對這些結果的最簡單解釋是因為胚胎期間血液連通，雙生牛有細胞交換，而不僅Lillie提出的分子交換。交換的細胞可能有紅細胞的胚胎前體細胞，這樣在成年動物血液發(fā)生系統(tǒng)中一生不斷產(chǎn)生新的紅細胞。
Owen提出其研究的一個應用：可以在早期通過檢測血型抗原性知道雙生牛是否有血液連通，如果有連通，其抗原就會完全一樣，是freemartin而不用繼續(xù)養(yǎng)。如果不一樣則說明它們胎兒期間無連同血液，這種小母?？梢岳^續(xù)養(yǎng)。這種早期診斷freemartins的方法，可以為農(nóng)民節(jié)省資源。Owen回饋了類似自己父母的眾多農(nóng)民。
Owen再觀察到一對牛生的5胞胎，它們分別來自五個受精卵，但檢測其血型14種抗原，發(fā)現(xiàn)完全一樣，而且它們都擁有父母分別擁有的抗原（Owen et al., 1946）。Davis加州大學的研究者在羊也觀察到類似的結果（Stormont, Weir and Lane，1953）。
注意Owen研究的科學家不多。澳大利亞的科學家提出：Owen的實驗的重要意義在于，胚胎期間種植的外源細胞可以被宿主永遠耐受（Burnet and Fenner，1949）。
澳大利亞免疫學家Frank Macfarlane Burnet（1899-1985）長期在位于墨爾本的Walter and Eliza Hall醫(yī)學研究所工作。在總結Owen研究的意義時（Burnet and Fenner，1949），他們還回顧了多個相關研究結果：大鼠肉瘤種植到成年雞引起免疫反應，而種植到雞胚不引起免疫反應（Murphy，1913）；白喉類毒素注射到雞胚不引起免疫反應（Grasset，1929）；在兔（Baumgartner，1937）和雞（Wolfe and Dilks，1948）都呈現(xiàn)越年幼的動物其免疫反應越低；接種到12天雞胚的流感病毒，在第14天小雞檢測不到抗體，而在成年雞接種可以引起抗體反應（Burnet，1941）。
我們還記得：Landsteiner文章表3胎盤的紅細胞血型就不容易定，他當時決定擱置不考慮胎盤結果（Landsteiner，1901）。而這也是動物年齡與免疫反應關系。
南非出生的英國生物學家Peter Medawar （1915-1987）和他的同事在研究雙生牛的皮膚時發(fā)現(xiàn)，如果進行皮膚移植，不僅同卵雙生的牛之間沒有排斥反應，異卵雙生的牛（即使其性別不同）之間皮膚移植也沒有排斥反應，而兄弟姐妹之間皮膚移植有排斥反應（Anderson et al., 1951；Billingham et al.，1952）。Medawar等認為這與Owen的發(fā)現(xiàn)一致。他們認為不太可能是移植物的抗原變化而適應宿主，推測是宿主成年產(chǎn)生抗體的免疫系統(tǒng)對胚胎期見過的抗原不再反應。為此，他們進一步實驗，發(fā)現(xiàn)“主動獲得性免疫耐受”。他們較為詳細地敘述實驗73（Billingham，Brent，Medawar，1953）。將來自一種小鼠（A）睪丸、腎臟、脾臟等器官組織的成年細胞注射到另一種（CBA）孕鼠的胚胎，5只幼鼠出生8周后，將A皮膚移植到CBA鼠，再等11天后，2只小鼠排斥移植皮膚，而三只小鼠對A的皮膚類似其對自體皮膚的移植，完全成功地接受了移植的皮膚。50天后再移植A的皮膚，也完全沒有免疫排斥。第77和101天，研究者從對A有強烈免疫性的CBA小鼠取得淋巴結，腹腔注射入胚胎期間接受過A皮膚移植的小鼠，移植的皮膚兩三天內(nèi)就脫落。接受過移植的CBA小鼠產(chǎn)生的后代對A皮膚仍然排斥。這一實驗說明，移植皮膚的抗原性并未消失，也并非因胚胎期間注射的A細胞長期存活，在成年競爭抗體。免疫耐受不能遺傳給后代。他們還有其他實驗表明，主動獲得性免疫耐受有抗原特異性，胚胎期注射A細胞的CBA鼠，對A的免疫反應降低，但對AU鼠來源的皮膚免疫反應不變。他們給96只出生后的新生小鼠注射外源抗原，難以引起免疫耐受。他們還用雞做了實驗，將11天的Rhode Island Red雞胚的血細胞注射同齡到White Leghorn雞胚，孵出14天后，Rhode Island Red的皮膚移植到White Leghorn的成功率也顯著提高（Billingham，Brent，Medawar，1953）。他們后來用了更多種屬的動物（包括兔、大鼠和雙胞胎的雞）、樣本量和統(tǒng)計證明主動獲得性免疫耐受（Billingham，Brent，Medawar，1956）。Medawar的基本結論，很快被其他研究者證明（Simonsen，1955，1956，1957；Ha?ek and Hraba，1955）。
1948年，Burnet提出自我標記物（self markers），認為個體對自己的細胞不發(fā)生免疫反應的原因是每個細胞上都有少數(shù)幾個自我標記物（Burnet and Fenner，1948），但不清楚自我標記物與胚胎免疫耐受的關系（Burnet and Fenner，1949）。他對自我標記的想法持續(xù)到1956年（Burnet，1956）。免疫耐受可以有兩種方法發(fā)生：要么身體的抗原都被抗體產(chǎn)生機制所識別為自我，要么所有外來抗原都被識別是異物（Burnet，1959）。Medawar的主動獲得性免疫耐受實驗說明免疫系統(tǒng)不需要識別自我，而只需要在胚胎時期清除識別自我的免疫機制，出生后新遇到的都是非我抗原。Burnet后來也承認自我標記物為半神秘的、缺乏吸引力（Burnet，1959）。Burnet在克隆選擇學說中提出胚胎期間身體不同組分直接相互作用，導致出生后不產(chǎn)生對身體可接觸部分的抗體（Burnet，1957，1959）。
免疫耐受還有更復雜和有趣的機理。宿主可以對移植物有免疫反應，還有移植物對宿主的免疫反應。而主要組織相容性復合物（Major histocampability complex，MHC）的作用更是妙趣橫生，但不在本章范圍。
抗體的產(chǎn)生和作用：側鏈學說
免疫學家多年試圖理解抗體形成的機理。
1900年，Ehrlich提出側鏈學說（side-chain theory）是第一個有影響的解釋抗體形成過程和作用機理的學說（Ehrlich，1900）。
Ehrlich的側鏈學說，與其早期研究不能全然分開（Ehrlich，1878，1885，1897；Ehrlich and Morgenroth，1900c；Prüll et al., 2009）。1878年，他在博士論文中提出染料與細胞結合需要“細胞特定的化學特征”。1885年，他首次提出側鏈（side-chains），認為細胞的原生質(zhì)有起細胞主要作用的化學分子核團，也有起營養(yǎng)作用的化學分子側鏈（Ehrlich，1885）。1897年，Ehrlich提出了側鏈學說的雛形（Ehrlich，1897）：細胞的側鏈結合毒素，結合之后側鏈不能起正常功能從而使細胞補償性地產(chǎn)生更多的側鏈，進入血液成為抗體，這一雛形相當接近他1900年的學說，只是尚未明確提出側鏈在細胞膜。Ehrlich雖然起初認為抗毒素結合毒素之后可以破壞毒素，后來認為抗毒素是中和毒素的作用（Ehrlich，1898，1899）。
1900年的文章中，Ehrlich全面闡述其側鏈學說。他提出，細胞的原生質(zhì)有起細胞特異功能的中心部分，也有起營養(yǎng)作用的側鏈。根據(jù)不同細胞的需求，側鏈有所不同。側鏈與營養(yǎng)物質(zhì)結合，營養(yǎng)物質(zhì)的原子團與側鏈相應的原子團發(fā)生特異的結合。這種結合類似于Emil Fischer（1852-1919）提出的酶和底物的鎖和鑰匙的關系（Fischer，1894）。Ehrlich提出毒素有兩部分，結合部分（haptophore）與細胞的側鏈結合，毒性部分（toxophore）起毒性作用。如果細胞無側鏈，毒素不會對它起毒性作用，有天然免疫。如果細胞的側鏈與毒素結合足夠強，可以中和其毒性。如果給予毒素的劑量合適，側鏈結合毒素后可以不斷再生，產(chǎn)生新的側鏈太多后，被分泌入血液，成為抗毒素。免疫的過程就是細胞產(chǎn)生和分泌側鏈的過程，血清的抗毒素或抗體來源于細胞的側鏈。
他還提出，不同的抗體可能來源于身體不同的細胞。單個抗體的免疫力可能不足，需要多個抗體。用整體細菌比用細菌細胞單個代謝產(chǎn)物更有效誘導多種抗體產(chǎn)生，這樣免疫力更強。
側鏈學說面臨很多批評。首先，如何解釋免疫系統(tǒng)事先存在對大量抗原有特異性的抗體。其次，如果抗體存在于毒素作用的靶細胞，那么如何解釋免疫存在于血液而不存在于靶器官的情形。例如破傷風毒素作用于神經(jīng)系統(tǒng)，但其抗體不存在于神經(jīng)系統(tǒng)，而在血液。事后，可以看到毒素作用的靶細胞和抗體產(chǎn)生的細胞并非同一細胞，毒素作用的靶分子也無需是抗體分子，Ehrlich當時將兩種細胞、兩種與毒素結合的不同分子當成同一細胞、同一分子，解釋確實簡單，但并非體內(nèi)的實際情況。其三，側鏈起營養(yǎng)性作用的看法也備受質(zhì)疑（Silverstein，2002）。
但是，Ehrlich的側鏈學說考慮了抗原-抗體特異結合、抗體為體內(nèi)已有分子、抗原選擇性促進抗體產(chǎn)生等因素，是第一個有影響的抗體形成理論。在其前后，曾有幾位研究者推測抗體來源于抗原，都被棄之不用且不影響以后的理論（Hertzfeld and Klinger，1918；Silverstein，2009）。
克隆選擇學說
抗體形成的理論需要解釋當時已知現(xiàn)象：對抗原的特異性，對多種抗原的反應，第二次引入抗原導致的反應大于第一次（Glenny and Südmersen，1921），對自身的抗原有免疫耐受。
抗體形成有直接模板學說、間接模板學說和選擇學說。
Ehrlich的側鏈學說是選擇學說的第一個版本。
直接模板學說有幾個版本，都認為抗原直接作為抗體的模板（Bail and Tsuda，1909；Breinl and Haurowitz，1930；Mudd，1932；Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）?？梢允菄@抗原進行抗體合成或組裝（Mudd，1932），或在抗原誘導抗體改變其構型從而特異結合和識別（Pauling，1940；Pauling and Delbrück，1940；Pauling, Campbell and Pressman，1943）。
抗體形成的間接模板學說首先由Burnet等提出。1941年，他們提出適應酶學說，認為抗原進入產(chǎn)生抗體的細胞后，通過誘導酶的改變，讓細胞生產(chǎn)對抗原特異的抗體（Burnet et al.，1941）。1949年，他們提出抗原進入細胞核或細胞漿，改變細胞的遺傳物質(zhì)，導致能夠識別抗原的特異抗體產(chǎn)生（Burnet and Fenner，1949）。這一假說，到1955年Burnet寫作時出現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)互為模板、自我標記物改變模板的復雜版本（Burnet，1956）。
1955年，丹麥免疫學家Niels Jerne（1911-1994）提出抗體形成的自然選擇學說：抗原進入身體后，在大量的已有抗體中與其中有互補構型的抗體相結合，抗原-抗體復合物被吞食細胞所攝取，之后抗原-抗體分開，抗原被破壞?？乖?抗體進入細胞后，引起細胞合成更多的同一抗體，改變血清中抗體的組成比，同一抗原再次進入體內(nèi)時將遇到更多的這一抗體，而且有更多產(chǎn)生這一抗體的細胞，所以反應更大。
1957年，平壤出生的當時在美國芝加哥大學的David Talmage（1919-2014）從過敏的實質(zhì)是免疫的觀點出發(fā)，認為要理解過敏就要理解抗體，從而討論抗體的產(chǎn)生。他指出Jerne的理論在本質(zhì)上與Ehrlich的側鏈學說有相似性：都是抗原選擇抗體。但他們的差別在于Jerne認為抗原與游離的抗體結合，而Ehrlich提出抗原與細胞膜表面的抗體結合。Talmage認為細胞表面的抗體更合理，抗原選擇表面有特定抗體的細胞，導致細胞增殖，產(chǎn)生更多的同一抗體（Talmage，1957）。
在以上基礎上，多年思考抗體形成機理的Burnet提出了抗體形成的克隆選擇學說（Burnet，1957）。Burnet長期研究病毒，但因參與調(diào)查疫苗事故而研究免疫學，并觀察到胚胎與免疫耐受的關系（Burnet, 1941）和第二次免疫反應大于第一次免疫反應的現(xiàn)象（Burnet et al., 1941）。很難用直接模板學說解釋為什么第二次免疫反應大于第一次（Glenny and Südmersen，1921；Burnet et al., 1941）。Burnet持續(xù)認真思考免疫學理論（Burnet，1948，1949），對Owen、Jerne和Talmage的文章都很敏感，再版書的時候不斷根據(jù)新的進展更新自己的理論。
1957年8月的一個周末，Burnet寫下了抗體形成的克隆選擇學說（Burnet，1957）。他首先回顧了Talmage（1957）對于抗體形成理論的三種分類：直接模板、間接模板和Jerne（1955）的選擇學說。他指出自己曾提出的區(qū)別自我和非我的“自我標記”想法現(xiàn)在看來是錯誤的，當時實在難以想象免疫系統(tǒng)怎么可能識別所有外來抗原。Burnet認為體內(nèi)已有自然抗體的多樣性可以很好解決區(qū)別自我和非我的問題，然后復述了Jerne的選擇學說。Burnet指出Talmage（1957）認為Jerne的學說是Ehrlich側鏈學說的擴展，并提出選擇是在細胞水平進行。Burnet提到自己在Talmage文章之前有類似想法，但不僅是細胞，而且是同樣細胞的克隆?？贵w產(chǎn)生細胞的表面含抗原反應位點，這些位點與同一細胞合成的抗體一致（它們識別同樣的抗原）。這些細胞可以釋放抗體，也可以增殖產(chǎn)生更多同樣的細胞?？乖M入身體后，附著到含結合其位點的細胞上，刺激細胞增殖（Gowans，1957；Simonsen，1957）。能夠識別抗原的細胞得到刺激而增殖，其后代可以分泌相應的可溶性抗體，從而產(chǎn)生免疫反應。第二次免疫時，因為已有增殖的細胞，所以反應大于第一次。
Burnet在美國Vanderbilt大學進行系列演講后，在其后的書中更詳細地進行了闡述（Burnet，1959）。他先復習了細菌和病毒的克隆、突變和選擇。再列舉了免疫的基本事實：抗體是血清中的球蛋白，第一次和第二次免疫反應的差別，對自身的免疫耐受，淋巴組織的細胞參與免疫反應等。他已明確指出產(chǎn)生抗體的細胞是淋巴細胞及其相關的漿細胞（Fagraeus，1947；Coons, Leduc and Connolly，1955）。他也分析了產(chǎn)生自身耐受的可能機理。在抗體形成理論方面，他回顧了Ehrlich的側鏈理論、Haurowitz-Pauling的直接模板理論、Burnet-Fenner的間接模板理論、Jerne的自然選擇理論和克隆選擇理論。
Burnet也明確提出：胚胎發(fā)育早期，有多種細胞，分別可以產(chǎn)生不同的抗體。與自身已有抗原接觸后，有反應的細胞被清除，因而有自身免疫耐受。出生后，釋放抗體，或產(chǎn)生抗體。
Talmage和Burnet都意識到，他們的假說帶來兩個要求：每種細胞只產(chǎn)生一種抗體（Talmage，1957；Burnet，1957）；Jerne、Talmage和Burnet的假說都需要個體能夠產(chǎn)生數(shù)量很多的不同抗體。第一個要求很快被證明。第二個問題需要較長時間。
Gustav Nossal（1931-）醫(yī)學院畢業(yè)后到Burnet實驗室讀研究生。他和來訪的美國生物學家Joshua Lederberg（1925-2008）合作，用針對細菌鞭毛的抗體證明單個脾臟來源的細胞只能產(chǎn)生一種抗體（Nossal and Lederberg，1958；Nossal，1958），這一實驗最后可以做到3628個細胞，只有兩個細胞可能產(chǎn)生了兩種抗體（或一種可以識別兩個抗原的二價抗體），而其他3626個細胞都只能產(chǎn)生一種抗體（Nossal and M?kel?，1960）。
1965年，確定了產(chǎn)生抗體的淋巴細胞（B淋巴細胞）的來源（Cooper, Peterson and Good，1965）。造血干細胞產(chǎn)生前B細胞，成為B細胞，受抗原刺激后成為漿細胞，漿細胞分泌抗體。
抗體蛋白質(zhì)的基本結構
抗體是蛋白質(zhì)為多年研究的結論（e.g.，F(xiàn)elton，1928；Heidelberger and Kendall，1929，1935，1936；McFarlane，1935；Chow and Wu，1936；Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938；Pauling，1940；Scheer, Lagsdin and Wyckoff，1941；Scheer et al., 1941）。按蛋白質(zhì)電泳特征稱為γ球蛋白（中文曾稱為丙種球蛋白）（Tiselius，1937；Tiselius and Kabat，1938），按功能稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。
主要在英國國家醫(yī)學研究所的Rodney Porter（1917-1985）、主要工作在美國佛羅里達大學和印第安納大學的Frank Putnam（1917-2006）和洛克菲勒大學的Gerald Edelman（1929-2014）等實驗室揭示了Ig的基本結構（Porter，1959；Edelman and Poulik,1961; Edelman and Gally, 1962，1967；Putnam et al., 1963；Edelman et al., 1969）。Ig可以被木瓜蛋白酶(和胰蛋白酶)切為Fab段和Fc段（Porter，1950；Fried and Putnam，1960；Nisonoff et al.，1959），又可以通過二硫鍵還原分開（Edelman，1959； Nisonoff et al., 1960；Franěk，1961），由重鏈和輕鏈組成（Edelman and Poulik，1961）。1963年了解的抗體基本結構如圖（Fleischman, Porter and Press，1963）：
到1967年確定一條輕鏈全部序列（Wikler et al., 1967）、1969年確定同一個Ig的輕鏈和重鏈全部序列后獲得更準確的結構（Edelman et al., 1969）。一般哺乳動物Ig的概貌：兩條輕鏈和兩條重鏈，輕鏈兩百多氨基酸殘基、重鏈五百多氨基酸殘基。兩條重鏈之間以二硫鍵共價連接，輕鏈也以二硫鍵分別與一條重鏈結合。重鏈和輕鏈的氨基端為可變區(qū)域（V區(qū)），九十多個氨基酸組成，V區(qū)差異最大的部分被推斷為抗體結合區(qū)域（Wu and Kabat，1970）。重鏈的羧基部分為恒定區(qū)域（C區(qū)）可以與補體結合，引起補體反應。
1968年，美國國家健康研究院（NIH）的科學家解析了Ig的晶體結構（Terry, Matthew and Davis, 1968）。此后進一步工作得到更精確的結果（Silverton, Navia and Davis，1978）。
按照其Fc段的差別，Ig通常分為五類：IgA，IgD，IgE，IgG，IgM。在抗原第一次刺激B細胞時，B細胞表面主要是IgM、IgD，之后出現(xiàn)類型轉變（class switching）（Wang et al., 1970），產(chǎn)生和分泌IgG（和IgE、IgA）。
IgD、IgE和IgG的結構為典型的兩條輕鏈和兩條重鏈。而IgA是二聚體，由兩個這樣的亞單位組成。IgM是五聚體，由五個同樣的亞基組成。導致紅細胞（和細菌）凝集反應的原因是一般Ig至少有兩個結合位點，可以同時結合抗原性相同的兩個細胞。而多聚體的抗體更可以結合更多具有相同抗原的細胞。
對Ig的蛋白質(zhì)研究得益于發(fā)現(xiàn)“Bences-Jones蛋白質(zhì)”。1884年，英國醫(yī)生Henry Bence Jones（1813-1873）從當時所謂“軟骨病”人的尿液分析發(fā)現(xiàn)后來稱為Bence Jones蛋白質(zhì)的物質(zhì)（Bence Jones，1848）。這種病人實際是多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma）。從孤兒成長為科學家的Putnam多年研究骨髓瘤分泌的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)它們是Ig（Putnam and Udin，1953；Putnam，1962）。Edelman確定它們是Ig的輕鏈（Edelman and Poulik，1962；Edelman and Gally，1962），每一骨髓瘤分泌單一的（“單克隆”）Ig輕鏈（Potter et al.，1964）?？梢杂没瘜W誘變劑導致正常鼠發(fā)生骨髓瘤（Potter and Boyce，1962），得到不同的骨髓瘤用于研究。發(fā)現(xiàn)骨髓瘤的抗體特征為發(fā)明單克隆抗體的制備技術奠定了基礎，當時很快因為可以幫助獲得大量同一蛋白質(zhì)而有助于研究Ig的氨基酸序列。輕鏈的氨基酸序列得到確定（Hilschman and Craig，1965；Titani et al., 1965；Bennett et al.，1965；Putnam, Titani and Whitley，1966；Titani, Shinoda and Putnam，1969）。同一Ig的全部氨基酸序列也得到確定（Edelman et al., 1969），從而明確同一Ig重鏈和輕鏈的V區(qū)相似，更清晰重鏈和輕鏈有多少個二硫鍵相連。
抗體多樣性產(chǎn)生的多種可能模型
一個人的一生中可以產(chǎn)生很多種抗體，有一種估計是1011種抗體。
動物可以產(chǎn)生特異的抗體不僅對毒素、對病原菌，而且對化學分子，包括自然界不存在的化學分子。Landsteiner發(fā)現(xiàn)有很多化學差別能夠引起不同的抗體，讓人們大開眼界認識到多樣性不是僅僅針對病原菌，而是識別化學特異性（Landsteiner，1936）。
每個動物的個體如何產(chǎn)生數(shù)量眾多的不同抗體?
爭論的核心問題在于：“多基因”對“少基因”， “種系發(fā)生細胞”對“體細胞”。一種觀點認為抗體的基因全是進化過程中積累產(chǎn)生了，在種系發(fā)生細胞有很多編碼抗體蛋白質(zhì)的基因，甚至一一對應各種不同的抗體。另一觀點認為種系發(fā)生細胞只有很少與抗體蛋白質(zhì)相應的基因，在體細胞分化過程中產(chǎn)生更多基因（或其重組、突變）而編碼所有抗體。
曾有多個假說，例如：
1）多年認為抗體產(chǎn)生有如酶的適應性的Burnet曾認為無需提出基因是抗體特異性的原因（Burnet and Fenner，1948）；
2）分子生物學家Lederberg于1959年提出基因與抗體的關系：抗體蛋白質(zhì)的特異性由其特定氨基酸序列所決定；產(chǎn)生特定抗體的細胞含相應的特定核苷酸序列；抗體形成細胞的基因多樣性源自其一生增殖過程中很高的自發(fā)突變率；高突變率包括細胞增殖某些時期Ig的DNA組裝隨機性。每個細胞在開始成熟時，按其基因型自發(fā)產(chǎn)生少量抗體；未成熟的抗體形成細胞在遇到同源抗原時被抑制（可以是消除細胞）；成熟的抗體形成細胞在同源刺激下成為漿細胞；抗原刺激的成熟細胞增殖，但基因型穩(wěn)定，因而細胞克隆增大，產(chǎn)生同源抗體；抗原消失后，這些克隆仍然存在，一旦遇到同樣抗原可以很快出現(xiàn)抗體反應（Lederberg，1959）；
3）物理學家Leo Szilard（1898-1964）于1960年提出抗體產(chǎn)生的理論。從細菌基因的重量和哺乳動物一個細胞內(nèi)DNA的重量，他推算一個細胞內(nèi)可有一百萬種基因，他認為每一種抗原可以進入細胞內(nèi)，通過結合特異的酶，而酶影響特異的抑制子，抑制子抑制特異抗體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，抗原的作用在于對相應抗體的產(chǎn)生去抑制（Szilard，1960）。這一理論需要在種系發(fā)生細胞就存在很多基因，不需要體細胞基因改變。這一理論的基礎之一（細胞所含基因數(shù)量）錯了，1990年代全基因組測序顯示人的細胞能夠編碼蛋白質(zhì)的基因約兩萬而已；
4）1962年，當時在美國Wisconsin大學的英國科學家Oliver Smithies（1925-2017）等提出結合珠蛋白（haptoglobin）的基因可以有基因重組（特別是基因復制duplication）和點突變（Smithies, Connell and Dixon，1962）。1963年，Smithies提出同一條染色體基因重組（特別是基因交叉及其導致的倒位）是Ig多樣性的機理之一，另一機理為Ig基因的堿基突變（增加或減少堿基導致移碼突變）（Smithies，1963；1967）；
5）1965年，加州理工學院的William Dreyer（1928-2004）和Claude Bennett提出：在種系發(fā)生細胞的同一條染色體上，一部分由多個編碼V區(qū)的序列重復組成（例如成為環(huán)狀DNA）。而編碼C區(qū)的序列可以如細菌病毒形成過程一樣在染色體之外。在體細胞分化過程中，C區(qū)域的DNA只與V區(qū)域序列之一（多個環(huán)之一）匹配而產(chǎn)生獨特的輕鏈（Dreyer and Bennett，1965）；
6）意大利納布納斯國際遺傳學和生物物理學實驗室的科學家提出：編碼Ig的基因其遺傳密碼有特殊性，同一個密碼可以被翻譯成為不同的氨基酸（Potter，Appella，Geisser，1965）。也許從幾百個特殊區(qū)域選其中一到兩個與C區(qū)組成一條Ig（Cioli and Baglion，1966）；
7）Leroy Hood（1938-）成為加州理工學院Dreyer的研究生，他們提出：N端V區(qū)的肽段與C端分別由兩個基因指導編碼產(chǎn)生，之后兩個肽段由酶促反應所連接稱為單個肽段，或編碼N端和C端的兩個基因融合、或其RNA融合（Hood, Gray and Dreyer，1966）；
8）劍橋的英國醫(yī)學研究基金會（MRC）的分子生物學實驗室（LMB）的分子生物學家Sydney Brenner（1927-2019）與免疫學家César Milstein（1927-2002）提出：編碼共同區(qū)域的核酸序列是酶的識別位點，這種酶切割DNA，切割后DNA在修復過程中在V區(qū)引入變異（Brenner and Milstein，1966）；
9）Edelman提出：在進化過程中，編碼Ig的基因發(fā)生串接重復（tandem duplication），可能重復到50個左右。它們出現(xiàn)點突變，從而不同。在哺乳動物個體的淋巴細胞成熟過程中，出現(xiàn)體細胞的DNA交叉（somatic cross-over），產(chǎn)生基因突變（Edelman and Gally，1967）；
10）劍橋大學植物系的遺傳學家提出在同一個染色體上，有多個編碼Ig的基因重復排列，淋巴細胞成熟過程中，發(fā)生同一染色體內(nèi)的交叉（intrachromosomal cross-over），兩個基因連在一起編碼一個Ig（Whitehouse，1967），這一假說在Dreyer and Bennett（1965）基礎上進了一步，編碼C區(qū)的基因不再是在染色體外，而是與編碼V區(qū)的基因同在一條染色體上；
11）伯克利加州大學科學家提出編碼V區(qū)域的基因與編碼C區(qū)域的基因需要在DNA或RNA水平連接（Koshland, Davis and Fujita，1969）;
12) 到1970年，Hood和Talmage還認為種系發(fā)生假說更有吸引力（Hood and Talmage，1970）；
13）Edelman提出：在淋巴細胞成熟過程中，編碼V區(qū)的多個基因中的一個因為基因轉位（translocation）而與編碼C區(qū)的連接在一起，編碼Ig（Gally and Edelman，1970）；
14）Jerne提出免疫器官是突變發(fā)生器官（mutant-breeding organs），其中淋巴細胞編碼Ig的基因出現(xiàn)體細胞基因突變，生成多種抗體（Jerne，1971）；
15）Salk研究所的Melvin Cohn（1922-2018）提出：所有體細胞都有低頻的基因突變，種系發(fā)生細胞有25到50個V基因，這些基因在體細胞中出現(xiàn)低頻突變，在高變異區(qū)域的突變比其他序列高10到100倍（Cohn，1971）；
16）英國國家醫(yī)學研究所的科學家提出有三套V基因，都存在于種系發(fā)生細胞（Williamson，1972）。
綜上所述，僅僅依據(jù)于當時已知Ig的輕鏈和重鏈有V區(qū)和C區(qū)、V區(qū)有多種氨基酸序列，可以提出多種假說。每一種假說都有其理由，而且提出者常指出其他假說為什么不對，但不能停留在猜測。
分子生物學實驗確定抗體產(chǎn)生的機理
只有實驗能確定抗體產(chǎn)生的確切機理。
種系發(fā)生細胞學說認為對應于每一個抗體（包括其V區(qū)）都有一個特定的基因，就有較多基因；而體細胞變異學說認為變異導致更多基因，早期不需要很多基因。所以，區(qū)分這兩類假說最簡單的方法是檢測編碼V區(qū)基因的數(shù)量。
第一個用實驗推測抗體基因數(shù)量的是美國西雅圖華盛頓大學的Ursula Storb。她取脾臟的DNA，放射性標記脾臟和骨髓瘤的RNA，看它們之間的雜交量，而加沒有標記的肝臟RNA作為沒有抗體RNA的來源。她假定肝臟RNA競爭掉了非Ig的基因結合，剩下的主要是Ig的基因與脾臟和骨髓瘤的RNA結合。以此，她得到結果推測每半個基因組有6千到1萬4千個序列可以編碼Ig的V區(qū)。因這一數(shù)量足夠大，她認為支持抗體變異的種系發(fā)生細胞學說（Storb，1972）。
這種方法有很多影響因素，推測不夠準確。更可靠的方法需要提取Ig重鏈或輕鏈的mRNA，在體外翻譯系統(tǒng)證明其編碼Ig，高度特異標記這種mRNA或其cDNA，檢測它與基因組DNA的雜交速率，從而推測DNA的拷貝數(shù)（Delovitch and Baglioni，1973）。在不能DNA測序的情況下，當時能用于分析DNA重復序列拷貝數(shù)的是C0t分析（Waring and Britten，1966；Britten and Kohne，1968）。以此方法，麻省理工學院（MIT）的科學家提取骨髓瘤MPC11中編碼Ig輕鏈的mRNA，它與肝臟或骨髓瘤的DNA雜交，推測重復數(shù)為40到500，不足以支持種系發(fā)生細胞學說 (Delovitch and Baglioni，1972，1973)。
紐約市立大學的研究者分析多種哺乳類動物的重鏈V區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)它們的變化有進化規(guī)律，而且有限，認為支持少基因的體細胞變異學說（Capra, Wasserman and Kehoe，1973）。
1974年，多個實驗室進行了C0t分析。Storb的結果推測有2500到5000個κ輕鏈的V區(qū)（Vκ）基因，繼續(xù)支持種系發(fā)生細胞學說（Storb，1974）。洛杉磯加州大學（UCLA）的Williamson推測重鏈的V區(qū)（VH）基因有5000個，也支持種系發(fā)生細胞學說（Premkumar，Shoyab and Williamson，1974）。但是，在瑞士Basel免疫研究所工作的日本科學家利根川進（1939-）等的結果都支持少基因學說。利根川進通過MPOC70E骨髓瘤獲得的結果推算小鼠每半基因組最低可能只有一個Vκ基因、最高200個（Tonegawa et al., 1974a）。劍橋大學的科學家用MPOC21骨髓瘤的結果推算有1到250個Vκ基因（Rabbits et al.，1974）。利根川進分析MPC11骨髓瘤的Ig重鏈基因推算小鼠每半基因組可能只有一個VH基因（Bernadini and Tonegawa, 1974）。瑞士科學家分析MPOC41骨髓瘤的結果支持只有兩個拷貝的CH基因（Faust, Diggelman and Mach，1974）。用高度純化的MPOC41來源的Cκ的mRNA，當時在NIH的Philip Leder （1934-）實驗室工作的本庶佑（Tasuku Honjo，1942-）等推測它只有2到3個拷貝，不支持種系發(fā)生細胞學說（Honjo et al.，1974）。舊金山加州大學的研究者也推測Cκ只有3到4個拷貝（Stavnezer et al.，1974）。利根川進在更嚴謹?shù)膶嶒灄l件下得到的數(shù)據(jù)進一步支持Vκ基因數(shù)量可能為1、不超過200（Tonegawa et al., 1974b）。
Milstein實驗室從MPOC21骨髓瘤純化了編碼其κ輕鏈的mRNA，并進行了DNA短片段的序列測定（Brownlee et al.，1973）。進一步分析多個小片段的序列后，他們確定編碼V區(qū)和編碼C區(qū)的核酸序列肯定在同一條mRNA上，從而明確是同一個基因編碼V區(qū)和C區(qū)兩段氨基酸序列（Milstein et al.，1974）。
Leder進一步研究發(fā)現(xiàn)，MPOC41的Ig基因編碼C區(qū)的拷貝數(shù)只有2.7，但編碼V區(qū)的拷貝數(shù)在30至50之間（Leder et al.，1974），他們提出在DNA或者RNA水平，需要有迄今未知的機理，將編碼V區(qū)的部分與編碼C區(qū)的部分連起來。
英國科學家還用MOPC21骨髓瘤進行分析推測V區(qū)和C區(qū)都只有幾個拷貝（Rabbits and Milstein，1975）。利根川進純化λ和κ輕鏈的mRNA達到90%以上的純度，發(fā)現(xiàn)λ和κ輕鏈的DNA一樣拷貝數(shù)有限，再加上當時已知的氨基酸序列，他推算約25種Vκ（或Vλ），不支持種系發(fā)生細胞學說（Tonegawa et al.，1976）。瑞士日內(nèi)瓦大學科學家分析MPOC41骨髓瘤編碼輕鏈的基因完全沒有重復，重復由污染的DNA造成（Farace et al.，1976）。本庶佑等推測Vλ只有兩個拷貝（Honjo et al.，1976）。
1976年，小泉純一郎（Nobumichi Hozumi，1943-）和利根川進設計簡單而巧妙的實驗檢測胚胎期的Ig基因與成體Ig基因的差別（Hozumi and Tonegawa，1976）。他們用Balb/c衍生的MOPC321骨髓瘤純化其編碼Igκ輕鏈的mRNA，比較12、13天Balb/c鼠胚和MOPC321與之雜交的DNA（編碼κ輕鏈的DNA）。他們用限制性內(nèi)切酶BamH1將基因組DNA切成小段，然后看哪些片段可以雜交κ輕鏈mRNA所制備的放射性標記的探針。他們將κ輕鏈的RNA探針分成全基因的探針和3’端的探針，因為C區(qū)在3’端，所以這兩個探針的差別部分應該是V區(qū)的信號。在胚胎中，κRNA探針可以雜交到兩個分子量分別為6.0和3.9百萬道爾頓的BamH1片段，其中6百萬道爾頓的片段只與全長的κRNA探針雜交，不與3’的κRNA探針雜交，3.9百萬道爾頓的片段與全長和3’的兩種κRNA探針都雜交，所以6百萬道爾頓的基因組BamH1片段應該含V區(qū)和C區(qū)，而3.9百萬道爾頓的片段只含C區(qū)、不含V區(qū)。在MOPC321骨髓瘤中，利根川進實驗室發(fā)現(xiàn)只有一個2.4百萬道爾頓的BamH1片段與全長和3’的兩種κRNA探針分別都雜交。他們的結果提示在胚胎中兩個不相連接的片段，而成熟的免疫細胞中成了一個片段，因此染色體發(fā)生了重組。他們認為不會是因為基因序列變化正好失去了BamH1的酶切位點，因為如果失去一個位點，長度應該是9.9而不是2.4百萬道爾頓。需要同時改變幾個BamH1切割位點的序列才能得到2.4百萬道爾頓的片段。以后他們換了限制性內(nèi)切酶也觀察到類似的變化，而且用λ輕鏈也觀察到類似變化（Tonegawa et al.，1977a）。Tonegawa討論了幾種V和C區(qū)基因重組的模型（Hozumi and Tonegawa，1976；Tonegawa et al.，1977a）。英國科學家用類似方法觀察到胚胎與骨髓瘤來源Ig基因的V區(qū)和C區(qū)有染色體重組，但以為V和C區(qū)即使在骨髓瘤仍并非緊鄰（Rabbits and Forster，1978）。
1973年，舊金山加州大學生物化學系的Herbert Boyer（1936-）和斯坦福大學微生物系的Stanley Cohen（1935-）發(fā)明重組DNA技術（Cohen et al.，1973）。DNA序列測定方法至1977年成功地建立（Wu，1972；Maxam and Gilbert，1977；Sanger, Nicklen and Coulson，1977）。
技術的進步推動了基因的分析。1977年，來源于12天鼠胚的Igλ輕鏈基因成為最早克隆的幾個基因之一（Tonegawa et al.，1977b），它含編碼V和C的部分。利根川進實驗室還克隆了HOPC2020骨髓瘤的λ輕鏈基因，也含編碼V和C的部分，用電子顯微鏡檢測雜交推算其Vλ和Cλ間隔1250堿基對（Brack and Tonegawa，1977）。Leder實驗室克隆了MOPC149骨髓瘤的兩種Vκ基因的DNA，發(fā)現(xiàn)可能有多種序列有差別的Vκ基因（Seidman et al.，1978）。利根川進實驗室克隆了全長的胚胎來源的λ輕鏈基因和HOPC2020來源的λ輕鏈基因，通過電鏡等分析確定V和C在淋巴細胞分化過程中應該有重組。重組應該發(fā)生在V和C之間的J序列，實際為V-J重組（Brack et al.，1978）。Leder實驗室分析了22種κ鏈的J序列，胚胎不僅有多個Vκ序列也有多個Jκ序列，在淋巴細胞成熟過程中，其中一個Vκ、一個Jκ經(jīng)過V-J的連接被選擇，但他們當時不確定其機理是DNA重組還是RNA剪接（Weigert et al.， 1978）。利根川進實驗室再克隆和分析鼠胚全部Jκ序列，其中有5個不同的Jκ序列，而成熟后漿細胞只有一個Jκ序列，他們分析認為在染色體V-J重組過程中，其間的序列失去而被選擇的Vκ與Jκ連接（Sakano et al.，1979）。Leder實驗室也有類似結論（Seidman, Max and Leder P，1979）。
1980年，加州理工學院的Hood實驗室、回日本東京大學的本庶佑實驗室、Basel免疫研究所的利根川進實驗室確定淋巴細胞成熟過程中Ig基因發(fā)生了兩次重組，一次是編碼V區(qū)的部分與編碼J序列的部分（V-J），一次是編碼J序列的與編碼C區(qū)的部分（J-C，亦稱class switching）（Davis et al.，1980；Kataoka et al.，1980；Sakano et al.，1980）。利根川進實驗室進一步發(fā)現(xiàn)在重鏈的J序列前面還有一段D（diversity）序列，一共有8種，所以還有V-D重組（Kurosawa and Tonegawa，1982）。
1983年，利根川進總結體細胞染色體重組如圖。
染色體重組的多樣性是Ig序列多樣性的一個重要來源。人的抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。人的14號染色體編碼Ig重鏈基因，由2號染色體編碼κ輕鏈，22號染色體編碼λ輕鏈。功能性重鏈基因片段包含46種V區(qū)段、23種D區(qū)段、6種J區(qū)段。功能性κ輕鏈有33種可能的V、5種J，無D區(qū)段。功能性λ輕鏈基因有33種V、5種J，無D區(qū)段。每一個抗體來自這些的組合，至少有5x1013種可能。這不僅是B淋巴細胞產(chǎn)生抗體多樣性的機理，也是T淋巴細胞表面受體的多樣性機理，人的T細胞受體因此可以有約1018種可能的組合。
重組激活基因的發(fā)現(xiàn)
Ig基因重組的分子機理在于重組酶。
1984年，分子生物學家David Baltimore（1938-）當時在MIT實驗室的研究生Susanna Lewis設計了實驗，用κ輕鏈基因的部分序列重構V-J重組。他們選取了鼠胚Vκ和Jκ及其附近的DNA序列，裝在病毒里面。將這種病毒感染淋巴細胞樣的體外培養(yǎng)細胞系PD。他們在序列Vκ和Jκ之間，裝了來自細菌的可以產(chǎn)生對霉酚酸起抵抗性的黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（xanthine-guanine phosphoribosyl transferase，gpt）。因為預計重組導致其間DNA序列翻轉，所以放到病毒的是反向的gpt序列。一旦發(fā)生Vκ和Jκ之間重組，其間的序列翻轉，gpt成為正向而可以表達GPT蛋白質(zhì)，細胞能夠抵抗霉酚酸。Lewis等成功地觀察到，她們的分子構造，轉染入PD細胞系后，經(jīng)過霉酚酸后得到的細胞株多數(shù)都是因出現(xiàn)了Vκ和Jκ之間DNA重組、gpt序列翻轉（Lewis et al.，1984）。
Baltimore實驗室的另一位研究生David Schatz用類似Lewis的方法，再構建了一個含B潮霉素抗性基因（hph）的病毒。用兩種病毒，他們檢驗了多種B細胞前體細胞樣的細胞系，多數(shù)能夠重組Vκ和Jκ之間DNA、翻轉gpt或hph抗性基因序列，導致細胞對霉酚酸或B潮霉素有抵抗性。但如果用同樣的病毒感染3T3成纖維細胞系，就不能發(fā)生Vκ和Jκ之間DNA重組（Schatz and Baltimore，1988）。Schatz在實驗室周會上講自己工作進展時，以色列來的博士后Yoav Citri（1953-1995）建議想辦法激活3T3細胞中的V（D）J重組活性，這一建議影響了后面的研究（Schatz and Baltimore，2004）。
要在3T3細胞發(fā)生Vκ和Jκ之間DNA重組，當時一般的設計應該是把可重組Vκ-Jκ的細胞（前B細胞）的mRNA做成cDNA文庫。文庫的大量不同cDNA轉染到3T3細胞，后者含有可以檢測Vκ和Jκ之間DNA重組的gpt或hph。在沒有轉染來自前B細胞cDNA的情況下，3T3細胞會被霉酚酸或B潮霉素殺死。而如果有前B細胞的cDNA導致Vκ和Jκ之間DNA重組，使得其間的gpt或hph基因成為可以表達的方向，從而有GPT或HPH合成，這樣的3T3細胞就能抵抗霉酚酸或B潮霉素。多數(shù)3T3細胞都被轉染了來自表達不能起重組酶作用的cDNA，這些3T3細胞會被霉酚酸或B潮霉素殺死，剩下可抵抗霉酚酸或B潮霉素的3T3細胞就很可能是表達了可以導致Vκ和Jκ之間DNA重組的重組酶的cDNA。
因為一種細胞表達很多mRNA從而可以得到很多不同的cDNA，如果是一種cDNA編碼重組酶，那么這種方法一般是可行的。但是，如果是多種cDNA編碼的蛋白質(zhì)才能引起Vκ和Jκ之間DNA重組，那么同時含有兩種或多種起作用的cDNA的幾率就會很小。Baltimore當時在Whitehead研究所的同事Robert Weinberg（1942-）用分子生物學研究癌癥，Weinberg實驗室用基因組DNA制備文庫。將這種文庫轉染到3T3細胞時，每個3T3被轉染的不會只是單個cDNA，而是一段基因組DNA，如果基因組DNA含相鄰幾個基因的時候，就可能是幾個基因。
Schatz把B淋巴瘤的基因組DNA轉染到3T3，基因組DNA接了一種抗性基因（組氨醇脫氫酶），首先用這種抗性基因針對的藥物（組氨醇）選擇被B淋巴瘤的基因組DNA轉染了的3T3細胞。然后用霉酚酸選擇發(fā)生了V-J重組的3T3細胞。他們從1500個抵抗組氨醇的3T3細胞克隆得到1個抗霉酚酸的3T3細胞株（Schatz and Baltimore，1988）。他們分析發(fā)現(xiàn)這一3T3細胞株確實出現(xiàn)了Vκ和Jκ之間DNA重組，使得其間的gpt表達，而不是其他原因對霉酚酸出現(xiàn)抵抗。但很多人不信，他們附近的實驗室認為他們的結果不可靠、發(fā)表的是偽跡（Schatz and Baltimore，2004）。
Schatz與研究生Marjorie Oettinger組成兩人合作，每天倒班、想方設法克隆重組激活基因（RAG）。他們用特定的寡核苷酸標記基因組的DNA，從出現(xiàn)重組的細胞中通過用于標記的寡核苷酸取得基因組DNA片段，以此克隆了RAG的催化亞基RAG-1（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。RAG-1基因編碼含一千余氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其同源基因存在于有V（D）J重組的動物如人、鼠、兔、羊、馬、雞、蛙。在人和鼠能夠進行V（D）J重組的細胞系，RAG-1也有表達。RAG-1表達于鼠的胸腺、骨髓和胚胎，而不在脾臟和腦表達。所以RAG-1表達的細胞和組織也與V（D）J重組活性相關。
在一派大好的形勢下，有個異數(shù)：含RAG-1基因的18kb DNA，催化V（D）J重組的活性居然與最初全基因組切的片段效率一樣，比預計的低100到1000倍。當時他們的估計是也許因為所用的基因組DNA不夠長，缺乏某些未知的轉錄控制元件和34個氨基酸（Schatz, Oettinger and Baltimore，1989）。但她們發(fā)現(xiàn)，得到全長的cDNA后，活性也不高（Oettinger et al.，1990）。他們經(jīng)過幾個月的迷惑不解，不斷提各種可能。其中一個比較難以置信的可能性是RAG-1旁邊碰巧還有一個基因，與它共同起作用（Schatz and Baltimore，2004）。在細菌中，已知相關功能的基因聚集在附近，而動物細胞的基因早已知道并非如此。
她們發(fā)現(xiàn)在原初有重組活性的18kb基因組DNA中，RAG-1基因只占其中6.6kb，另有11kb，余下的基因組DNA中還有一個基因。她們進一步的工作證明這個基因可以提高RAG-1重組效率1000倍，因此她們稱這一基因為RAG-2（Oettinger et al.，1990）。以后知道，RAG-1獨立進化自轉座酶Transib，后來又捕獲了RAG-2基因進一步增強其活性，之后RAG-1和RAG-2的序列和功能變化成為專門用于Ig基因重組的酶（Carmona and Schatz，2017）。
結語
哺乳動物體液免疫的主力為B淋巴細胞，它們在胚胎期間受到“馴化”，是區(qū)別自我和非我是產(chǎn)生免疫耐受的一種方式：凡是胚胎期接觸頻繁的已有抗原被認為是自身抗原，識別自身抗原的新成熟B細胞在骨髓中被抑制或被誘導死亡，剩下的細胞識別外來（或體內(nèi)以后異常而產(chǎn)生）的抗原。還有其他產(chǎn)生免疫耐受的方式。
抗體是蛋白質(zhì)，哺乳動物中除駱駝科動物抗體缺少輕鏈外，抗體一般由兩條輕鏈和兩條重鏈組成。它們有結合抗原的變異V區(qū)，和恒定的C區(qū)。在幼稚B細胞，編碼V區(qū)的有多個序列，還有多個J序列，和有限的C區(qū)。在重鏈還有位于J序列的N端的多個D序列。由染色體V（D）J重組導致特定的一種V序列與特定的一種D和/或J序列連接，重組的產(chǎn)物作為一個外顯子與C區(qū)一起表達成熟的Ig基因。因為重組過程中選擇和組合的多種可能而提供抗體的多樣性。此外，V（D）J重組過程中連接位點處序列的多樣性還可以得到增加：DNA斷裂位點連接之前的加工、處理，如堿基的隨機篩除（deletion），P序列增加（P Nucleotide Addition），由末端轉移酶（terminal dideoxy transferase, TdT）介導的N序列增加（non-template nucleotides addition）（Alt and Baltimore，1982；Desiderio et al.，1984）。
最初在B細胞表達的是膜結合的抗體Ig與2個跨膜蛋白Igα、Igβ組成的B細胞受體（BCR）（Raff, Steinberg and Taylor，1970）。BCR受抗原刺激后，通過Igα和Igβ將信號轉導給細胞內(nèi)，刺激B細胞增殖和分化成熟，包括基因突變和選擇，抗體親和力提高，成為漿細胞或記憶細胞。一旦再次得到抗原刺激，快速分泌抗體Ig。
除體細胞重組之外，Ig序列多樣性還有一個來源：體細胞高頻突變（somatic hypermutation）。在V（D）J外顯子區(qū)，特別是其與抗原結合的區(qū)域，特異酶催化單個堿基突變。體細胞基因突變，最早由Lederberg提出（Lederberg，1959），Brenner和Milstein進一步提出抗原結合區(qū)域的突變頻率可能高于其他序列（Brenner and Milstein，1966）。蛋白質(zhì)序列分析（Weigert et al., 1970）和基因測序發(fā)現(xiàn)確實有體細胞突變（Bernard，Hozumi and Tonegawa，1978；Brack et al.,1978），而且淋巴細胞接觸抗原時間越長、其Ig基因變異越多（Griffiths et al.，1984；Berek and Milstein，1987）。體細胞高突變的機理是活化誘導的脫胺酶（activation-indued deaminase，AID），它催化脫氧胞嘧啶脫胺，堿基變化及其修復導致Ig序列多種變化（Di Noia and Neuberger，2007；Teng and Papavasiliou，2007；Peled et al., 2008）。
免疫與疾病有雙重的密切關系。免疫過低導致罹患感染、增加癌癥的可能，免疫過強導致過敏反應和自身免疫性疾病。
免疫學研究不僅加深了人類對于免疫學原理的理解，也帶來了超出免疫學應用的技術。放射免疫檢測（Radioimmunoassay，RIA）（Yalow and Berson，1960）和酶聯(lián)免疫吸附檢測（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（Engvall and Perlmann，1971）用于定量檢測微量分子。流式細胞檢測（flow cytometry）、也稱熒光激活細胞分離器（fluorescence-activated cell sorter，F(xiàn)ACS）可以根據(jù)表面抗原和其他差異化的分子標記而分離多種細胞。克隆選擇學說的直接應用誕生了單克隆抗體技術，它不僅可以用于檢測、而且可以用于治療（K?hler and Milstein，1975）。免疫學原理和技術也有助于理解和治療非免疫系統(tǒng)的疾病（如癌癥的診斷和治療）。
注1：1901年的諾貝爾生理或醫(yī)學獎為什么只給了von Behring而不包括北里，討論的文章如：Kantha（1991）。本章涉及的免疫學工作獲諾獎的：Emil von Behring（1901）、élie Metchnikoff（1903）、Paul Ehrlich（1909）、Jules Bordet（1919）、Karl Landsteiner（1930）、Frank Macfarlane Burnet（1960）、Peter Medawar（1960）、Rosalyn Yalow (1977)，Niels Jerne（1984）、Rodney Porter（1972）、Gerald Edelman（1972）、Susumu Tonegawa（1987）。微生物學家科霍（Robert Koch）因其研究病原菌而獲獎（1905），分子生物學家Joshua Lederberg因研究細菌的遺傳學而獲獎（1958），分子生物學家David Baltimore因發(fā)現(xiàn)逆轉錄酶獲獎（1975），César Milstein因發(fā)明單克隆抗體技術獲獎（1984）， Oliver Smithies以后因發(fā)明基因敲除技術獲獎（2007），本庶佑以后因對腫瘤免疫的貢獻獲獎（2018）。
注2：英國Richard Lower的輸血實驗，1666年由他的同學Robert Boyle (1627-1691)提交皇家學會，并有Boyle的提問和建議 (Boyle，1666)。他們都是“牛津實驗哲學俱樂部”的成員。
注3：在博士論文中，Ehrlich發(fā)現(xiàn)肥大細胞（Ehrlich，1878）。在Charité醫(yī)院期間，他通過染色發(fā)現(xiàn)了中性粒細胞、嗜酸性白細胞、嗜堿性白細胞（Ehrlich，1891a）。他還研究了貧血和白血病，并參與主編《貧血》一書。因為Ehrlich在血液學的科學發(fā)現(xiàn)和技術發(fā)明，科學史家稱其為“血液學之父”（Wintrobe，1985）。
注4：Pfeiffer現(xiàn)象有兩方面意義，其二是發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素的起點。他發(fā)現(xiàn)加熱之后的霍亂弧菌還有毒性，所以提出細菌的細胞被破壞后，釋放了對熱不敏感的毒素。
注5：Landsteiner當時有沉重的病理解剖任務，1897年至1907年他做過3639次。在這樣的情況下，他發(fā)表了75篇論文（52篇血液學、12篇細菌學、11篇病理解剖學）。他有多項科學發(fā)現(xiàn)，除了血型之外，他于1909年與Erwin Popper醫(yī)生（1879-1955）發(fā)表他們對脊髓灰質(zhì)炎的研究，他們在1908年11月到12月的實驗成功地將脊髓灰質(zhì)炎從患者兒童引入猴，對發(fā)現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒起了很大作用。脊髓灰質(zhì)炎不能感染小鼠、豚鼠、或兔子，但可以感染猴，并且發(fā)病類似人。Landsteiner的血型研究，始于1900年文章的注腳，其后他經(jīng)常引用文章的頁碼是注腳出現(xiàn)的361頁，而不是全文的頁碼。他移民美國后在洛克菲勒醫(yī)學研究所工作，還發(fā)現(xiàn)了Rh血型（Landsteiner and Wiener，1940）。
注6：在Belfanti and Carbone（1898）的基礎上，Bordet（1899）和Ehrlich and Morgenroth（1900b）提出了補體（complement）的功能及其機理。Bordet稱補體為alexin, Ehrlich曾稱補體為addiment?？贵w一個位點與紅細胞結合，另一位點與補體結合。在本章所涉及的實驗中，凝集反應無需補體，溶血反應需要補體。
注7：當時所謂凝集紅細胞的凝集素，后來知道一般是IgM，人和鼠的IgM有五個亞基，可結合多個紅細胞，從而造成凝集。
注8：英國醫(yī)生、微生物學家Charles Todd（1869-1957）因為埃及出現(xiàn)每天死上千頭牛的牛瘟而于1904年到開羅工作。1910年6月，他在皇家學會宣讀論文（Todd and White，1910a），此后發(fā)表全文（Todd and White，1910b）。他們的研究基于Ehrlich and Morgenroth（1900a）用豚鼠做的實驗。Todd和White用106頭牛的血清和紅細胞在體外做研究。他們發(fā)現(xiàn)：與豚鼠一樣，每頭牛的血清不會對自己的紅細胞發(fā)生溶血反應，而會溶解一些其他牛的紅細胞。但如果事先將一頭牛的血清用另外一頭牛（A）的紅細胞進行共育一小時，然后再檢測這種血清，它不再溶A牛（和一些牛）的紅細胞，但繼續(xù)溶解其他一些牛的紅細胞。他們稱之為“耗竭”（exhaustion）。他們當時著重于牛的個體識別，而實際也給免疫耐受的理解埋下了伏筆。雖然免疫耐受是在細胞水平--而不是抗體分子水平--的去除。
注9：Burnet于1929年發(fā)現(xiàn)第二次免疫反應大于第一次，但這一結果被英國醫(yī)學雜志拒稿，他后來講其發(fā)表于1941年無需同行評審的研究所發(fā)行的單行本中的結果（Burnet et al.，1941）。他發(fā)表于1956年的書顯然是1955年寫作時還沒有Jerne的文章。Burnet對澳大利亞的科學有很大影響，1957年他決定將Walter and Eliza Hall研究所全部集中研究免疫學，使之長期成為國際免疫學研究重鎮(zhèn)。
注10：Gustav Nossal的曾祖父母是猶太人，因此其家庭也在希特勒時代被迫離開維也納移民澳大利亞。他從醫(yī)學院畢業(yè)后，對病毒研究很感興趣，1957年被推薦到Burnet實驗室讀研究生。結果發(fā)現(xiàn)Burnet“轉行”全部研究免疫，不再研究病毒，非常驚訝，非常不情愿。為了做實驗，他讀了文獻，特別注意到即將從美國來其所在澳大利亞研究所訪問的Joshua Lederberg的方法可以用于自己的研究。
注11：Joshua Lederberg因研究細菌間的遺傳物質(zhì)轉移而獲1958年諾貝爾獎。他當年已到澳大利亞與Burnet實驗室合作，后從Wisconsin搬到Stanford創(chuàng)辦遺傳學系。
文章頭圖及封面圖片來源：imperial.ac.uk
