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? 2017年5月18日，季維智、陳永昌研究團(tuán)隊和同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院孫毅在Cell雜志發(fā)表新成果。

撰文丨仇子龍  （中科院上海神經(jīng)科學(xué)研究所研究員、國家“杰青”）

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2006年春天，美國加州南部小鎮(zhèn)，一個安靜的美國家庭中突然來了很多客人，有加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）和圣迭戈分校（UCSD）的教授們，也有許多坐著輪椅的女孩。這些女孩坐在輪椅上，目光中透露出對世界的好奇，但是卻無法言語，手足間常常有不自主的顫動。女孩們有一個共同的特征，這就是她們體內(nèi)的MECP2基因都發(fā)生了嚴(yán)重的突變，導(dǎo)致她們患有瑞特綜合征（Rett syndrome）。

十年前，在這次由瑞特綜合征家長與瑞特綜合征研究基金會組織的病人與科學(xué)家見面會上，還在加州大學(xué)圣迭戈分校（UCSD）做博士后研究的我，第一次遇到了仰慕已久的加州大學(xué)洛杉磯分校的孫毅教授。

瑞特綜合征是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育性疾病，時至今日仍然沒有有效的治療方法，在20世紀(jì)60年代由Andreas Rett醫(yī)生首先予以定義。1999年，美國貝勒醫(yī)學(xué)院的Huda Zoghbi教授經(jīng)過艱苦的努力，尋找到了導(dǎo)致瑞特綜合征的“罪魁禍?zhǔn)住薄?em>MECP2基因，研究者發(fā)現(xiàn)95%的瑞特綜合征女孩都攜帶MECP2基因的突變。關(guān)于MECP2與瑞特綜合征的歷史，請看筆者的另一篇文章（1）。瑞特綜合征因為患者具有手部的刻板行為，早年被神經(jīng)科醫(yī)生歸為自閉癥譜系障礙（Autism spectrum disorder）。MECP2基因后來被發(fā)現(xiàn)基因的倍增會在男孩中導(dǎo)致嚴(yán)重自閉癥，因此它與自閉癥的關(guān)系始終非常密切，對MECP2基因的研究也為我們認(rèn)識了解自閉癥打開了一扇重要的窗戶。

當(dāng)時在UCLA的孫毅教授是MECP2研究領(lǐng)域的開辟者之一，2003年她與哈佛大學(xué)Mike Greenberg教授同時在Science雜志上發(fā)表文章，報道MECP2在神經(jīng)元中調(diào)控基因表達(dá)的新機(jī)理（2, 3）。孫毅教授后來在MECP2基因領(lǐng)域又有一系列出色的工作發(fā)表。于2006年獲得了瑞特綜合征研究基金會博后基金的我也正式開始了MECP2的研究工作。

與這次基金會組織的病人、科學(xué)家見面會一樣，對于瑞特綜合征的研究工作始終與病人無法分開。組織這次見面會的Monica就是一位瑞特綜合征女孩的媽媽，為了早日治愈她們的女兒，美國的一些瑞特綜合征家長組織起來成立了私人基金會，募集捐款，支持瑞特綜合征與MECP2相關(guān)的科學(xué)研究工作，她們深深了解科學(xué)在疾病治療過程中的巨大作用（見下圖）。在對MECP2進(jìn)行了漫長的科學(xué)研究后，我們對這個基因及其編碼蛋白的功能有了非常深入的了解，比如表觀遺傳學(xué)調(diào)控，小RNA剪切加工以及調(diào)控突觸可塑性等等。但病人家長和科學(xué)家們都迫切地想知道，基礎(chǔ)科學(xué)研究最終距離幫助這些瑞特綜合征孩子們究竟還有多遠(yuǎn)？

?Monica Coenraads和她的女兒Chelsea. HHMI Bulletin，2006

人類的大腦非常復(fù)雜，具有復(fù)雜的溝回以及大腦分區(qū)，作為我們最常用的實驗?zāi)Ｊ絼游铩∈髞碚f，其大腦的結(jié)構(gòu)雖然具有對應(yīng)的感覺與運動皮層等基本結(jié)構(gòu)——“麻雀雖小，五臟俱全”(見下圖)，但是對于瑞特綜合征這種復(fù)雜的腦疾病來說，與瑞特綜合征女孩一樣缺失了MECP2基因的小鼠，卻不能完整模擬人類病患的臨床病理特征 (4)。例如MECP2缺失的男孩無法出生，而缺失MECP2基因的雄性小鼠卻能活至近成年期，攜帶MECP2基因突變的雌性小鼠也通常能夠正常生育，直到6-9月后才會發(fā)病。是否有可能在盡可能接近人類的動物模型中建立瑞特綜合征的模型，從而加快應(yīng)對藥物的研發(fā)工作呢？

? 動物大腦比較左上角人類大腦，右下角實驗小鼠大腦，（DeFelipe 2011）

2009年，孫毅教授回國擔(dān)任上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞研究中心主任、千人計劃專家，2012年，她開始與云南中科靈長類生物醫(yī)學(xué)重點實驗室、昆明理工大學(xué)季維智教授一起，探討應(yīng)用非人靈長類——猴類來建立瑞特綜合征模型的可能性。2009年，我也從UCSD回到中科院上海神經(jīng)所，建立了自己的實驗室，開展了獨立的MECP2研究工作。

是否有可能在猴類中敲除MECP2基因？季維智教授長期從事獼猴胚胎干細(xì)胞及基因修飾構(gòu)建靈長類動物模型的工作，但是當(dāng)時的獼猴胚胎干細(xì)胞還不能像小鼠胚胎干細(xì)胞一樣發(fā)育成子代個體。從2010年開始，基因編輯方法的出現(xiàn)讓這一切成為可能，第一個出現(xiàn)的基因編輯工具為鋅指核酸酶（zinc finger nuclease），雖然可以對基因組中的基因進(jìn)行定點切割，但是效率不盡人意；第二類基因編輯工具TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）的出現(xiàn)，讓在細(xì)胞系中準(zhǔn)確進(jìn)行基因操作以及制作基因編輯動物的出現(xiàn)成為了可能。當(dāng)然于2013年1月被首次在哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯而被報道的第三類基因編輯工具CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)已經(jīng)成為傳奇，是目前最好的基因編輯工具。

2012年，當(dāng)TALEN方法被證明可以在小鼠受精卵中成功敲除目標(biāo)基因的時候，季維智教授、孫毅教授和在中科院神經(jīng)所的我都意識到千載難逢的機(jī)會就在眼前。如果TALEN的效率足夠高，直接將TALEN mRNA注射入獼猴受精卵，那么獼猴的MECP2基因就有可能被直接敲除！ 2012年底，季維智、孫毅教授團(tuán)隊和我們不約而同地開始了在猴類中進(jìn)行TALEN方法的基因打靶工作。2013年下半年，經(jīng)過食蟹猴漫長的近六個月懷孕期，第一批注射了打靶MECP2基因的TALEN mRNA的食蟹猴出生了（5, 6）。2013年，第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9也出現(xiàn)了，季維智教授與沙家豪教授、黃行許教授開展合作，運用CRISPR/Cas9方法建立的基因突變猴也于2013年底出生了（7）。這三個工作發(fā)表于2014年上半年，宣告人類在靈長類動物中進(jìn)行基因操控時代的到來（下圖）。

然而基因操控還只是第一步，基因突變猴是否能更好地模擬人類的瑞特綜合征女孩呢？季維智與孫毅教授的工作得到了數(shù)只攜帶MECP2基因突變的雌性食蟹猴，而我們只得到了一只攜帶MECP2基因缺失的雄性食蟹猴，出生不久便去世，因此我們將工作集中到了MECP2轉(zhuǎn)基因猴上，于2016年2月發(fā)表了MECP2轉(zhuǎn)基因猴模擬MECP2倍增綜合征病人自閉癥樣癥狀的文章（8）（下圖）。

? 2016年，仇子龍轉(zhuǎn)基因猴成果發(fā)表在Nature上

從2014年起，季維智教授與孫毅教授一起對MECP2基因突變猴開展了細(xì)致的功能研究，經(jīng)過漫長的雜志評審過程，此工作終于于2017年5月18日在線發(fā)表在國際頂級生物學(xué)期刊Cell上（9）。在此項工作中，他們首先對基因突變猴進(jìn)行了嚴(yán)格的基因測序及表達(dá)蛋白分析，證明了這些基因突變猴盡管還是基因突變的嵌合體，但是體內(nèi)的MECP2蛋白明顯表達(dá)下降，可以作為基因突變的模型進(jìn)行研究。

研究者接著與中科院自動化所蔣田仔研究員合作，運用核磁共振成像的方法研究了基因突變猴大腦的結(jié)構(gòu)，他們的結(jié)果顯示基因突變猴在多個腦區(qū)包括杏仁核與cingulate cortex等等出現(xiàn)結(jié)構(gòu)向的減小（下圖）。對猴類的大腦還可以做多種功能的腦成像，例如彌散張量成像（DTI）等。此類腦成像實驗無法對小鼠模型進(jìn)行研究，因為小鼠大腦結(jié)果相比之下太簡單，不具有如此復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。

? 基因突變猴在多個腦區(qū)包括杏仁核與cingulate cortex等等出現(xiàn)結(jié)構(gòu)向的減小

季維智教授與孫毅教授接下來與中科院昆明動物所胡新天研究員等進(jìn)行合作，對MECP2基因突變猴開展了一系列針對瑞特綜合征與自閉癥譜系障礙的行為學(xué)檢測。首先，他們發(fā)現(xiàn)在MECP2突變猴表現(xiàn)出睡眠障礙，出現(xiàn)更碎片化的睡眠狀況。在瑞特綜合征中睡眠障礙問題是非常突出的臨床癥狀之一。其次，研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)MECP2突變猴出現(xiàn)了一系列自閉癥樣癥狀，如主動社交接觸變少、刻板樣行為變多等。這些自閉癥樣行為在MECP2轉(zhuǎn)基因猴中也有報道（8）。季維智教授與孫毅教授的團(tuán)隊更進(jìn)一步，對MECP2基因突變猴進(jìn)行了一個更令人信服的實驗。我們知道自閉癥孩子通常不與別人目光對視，心理物理學(xué)家后來發(fā)現(xiàn)，如果對自閉癥孩子進(jìn)行嚴(yán)格的眼動跟蹤實驗，自閉癥孩子通常對人臉或者有感情的人臉無動于衷。研究者對MECP2基因突變猴也開展了這個實驗，這個實驗需要對基因突變猴及野生對照猴進(jìn)行長達(dá)數(shù)月的訓(xùn)練，才能讓猴子安靜的在椅子上坐著進(jìn)行認(rèn)知實驗。研究者發(fā)現(xiàn)，MECP2基因突變猴明顯降低了對有表情的猴臉的興趣，對明顯更有攻擊性和屈服的猴臉表示沒有興趣，而對面無表情的猴臉予以更多的關(guān)注（見下圖）。這個實驗進(jìn)一步令人信服地表明，猴類做為腦疾病的模型有小鼠模型無法比擬的優(yōu)勢。

? 基因突變猴及野生猴對照實驗

經(jīng)過這些研究，季維智教授與孫毅教授首次對經(jīng)過基因編輯的MECP2突變猴進(jìn)行了詳盡的生理學(xué)與行為學(xué)研究，為在基因突變猴中，開展下一階段的藥物篩選實驗打下了堅實的基礎(chǔ)。此工作也再一次證明了獼猴作為腦疾病的動物模型，比小鼠模型具有更大的優(yōu)勢。

隨著國內(nèi)遺傳病基因檢測水平的進(jìn)步，國內(nèi)的醫(yī)院也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多罹患瑞特綜合征的孩子們。對瑞特綜合征這一腦疾病的攻堅戰(zhàn)已經(jīng)打響，對瑞特綜合征的研究與臨床干預(yù)的嘗試，也會將對自閉癥譜系障礙的研究起到極大的推動作用。讓我們共同期待科學(xué)家與醫(yī)生攜手攻克瑞特綜合征這一天的到來！

注：本文首發(fā)于微信公號：Bioart，《知識分子》獲作者授權(quán)刊發(fā)。

參考文獻(xiàn)

1.  逆轉(zhuǎn)基因決定的命運：自閉癥研究或現(xiàn)曙光 知識分子公眾號 2016年6月2日，原載于《生命的化學(xué)》

2. Chen et al. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2. Science. 2003 Oct 31;302(5646):885-9.

3. Martinowich et al. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation.Science. 2003 Oct 31;302(5646):890-3.z

4. Guy et al. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat Genet. 2001 Mar;27(3):322-6.

5. Liu et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys. Cell Stem Cell. 2014 Mar 6;14(3):323-8

6. Liu et al. Generation of a monkey with MECP2 mutations by TALEN-based gene targeting. Neurosci Bull. 2014 Jun;30(3):381-6

7. Niu et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014 Feb 13;156(4):836-43

8. Liu et al. Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature. 2016 Feb 4;530(7588):98-102

9. Chen et al. Modeling Rett syndrome using TALEN-edited MECP2 mutant cynomolgus monkey. Cell (2017) 169,1-11. http://dx.doi.org/ 10.1016/j.cell.2017.04.035

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