20位科學(xué)家發(fā)文再質(zhì)疑NgAgo實驗結(jié)果 | 韓春雨回應(yīng)：近期已再次重復(fù)
?11月15日，20位科學(xué)家在學(xué)術(shù)期刊《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》（Protein & Cell）以來信（Letter）形式在線發(fā)表文章“關(guān)于NgAgo的疑問（Questions about NgAgo）”
撰文 | 陳曉雪
責(zé)編 | 李曉明
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備受關(guān)注的NgAgo可重復(fù)性爭議日前有了新進(jìn)展。
11月15日，學(xué)術(shù)期刊《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》（Protein & Cell）以來信（Letter）形式在線發(fā)表了一篇題為“關(guān)于NgAgo的疑問（Questions about NgAgo）”的文章，由國內(nèi)外20家實驗室的負(fù)責(zé)人聯(lián)合署名，對河北科技大學(xué)副教授韓春雨等人發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》（Nature Biotechnology）的論文結(jié)果提出質(zhì)疑，表示無法重復(fù)韓春雨的NgAgo實驗結(jié)果。
這20位作者名單中，有17位是國內(nèi)學(xué)者，其中包括10月10晚實名發(fā)聲“未能重復(fù)韓春雨實驗”并呼吁第三方介入調(diào)查的11位科學(xué)家（谷峰、黃志偉、李勁松、王皓毅、李偉、孫育杰、魏文勝、吳強、王曉群、熊敬維、楊輝），另有三位科學(xué)家在國外機構(gòu)任職，包括美國國立衛(wèi)生研究院人類基因組研究所資深研究員Shawn Burgess、美國約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授程臨釗以及美國加州大學(xué)洛杉磯分校教授林碩。
《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》（Protein & Cell）由高等教育出版社、北京生命科學(xué)院和中國生物物理學(xué)會2010年聯(lián)合創(chuàng)辦，清華大學(xué)教授、中科院院士饒子和擔(dān)任主編。
20位科學(xué)家稱實驗無法重復(fù)，
已排除細(xì)胞污染
?20位科學(xué)家針對韓春雨NgAgo論文圖4結(jié)果的重復(fù)實驗顯示，未能在靶向位點檢測到Indels。來源：Burgess, S., Cheng, L., Gu, F. et al. Protein Cell (2016).
?《自然-生物技術(shù)》刊發(fā)韓春雨NgAgo實驗結(jié)果顯示，DNA介導(dǎo)的基因編輯工具NgAgo可以在哺乳動物基因組的47個位點實現(xiàn)100%的基因編輯，效率為21.3%-41.3%。來源：Gao, Feng, et al. Nature Biotechnology (2016).
今年5月12日，韓春雨團(tuán)隊在《自然-生物技術(shù)》發(fā)表的文章顯示，DNA介導(dǎo)的基因編輯工具NgAgo可以在哺乳動物基因組的47個位點實現(xiàn)100%的基因編輯，效率為21.3%-41.3%。
在《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》發(fā)表的這篇來函文章中，署名的20位作者指出，他們在不同的細(xì)胞系以及小鼠、斑馬魚等系統(tǒng)中對NgAgo的基因編輯活性進(jìn)行了測試，但沒有一個實驗發(fā)現(xiàn)NgAgo能夠?qū)崿F(xiàn)韓春雨論文中所稱的基因組DNA的編輯。之后，一些作者轉(zhuǎn)而使用韓春雨使用的或提供的質(zhì)粒進(jìn)行重復(fù)實驗，“再一次，內(nèi)源基因組DNA的編輯沒有成功”。
作者們對韓春雨論文中的圖4結(jié)果也進(jìn)行了獨立重復(fù)實驗，在293T細(xì)胞中選擇了韓春雨論文報告的相同基因進(jìn)行測試?！皫讉€不同實驗室的研究者獨立完成了他們的實驗，但在靶向位點沒有觀察到任何Indels?！蔽恼聦懙?。Indel是分子生物學(xué)中的一個術(shù)語，是“insertion”（插入）和“deletion”（缺失）兩個單詞的縮寫，指的是在DNA中的核苷酸插入或缺失。因為NgAgo實現(xiàn)編輯基因的結(jié)果為插入或缺失Indel，無法觀察到Indel就被認(rèn)為不符合預(yù)期結(jié)果。
文章的補充材料中還包括署名作者們在不同系統(tǒng)中嘗試NgAgo的結(jié)果，“這些研究沒有一個證明NgAgo有基因組編輯的活性”。
此前，韓春雨曾多次在接受媒體采訪時稱，重復(fù)不出來的實驗室可能存在“細(xì)胞污染”等問題。作者們表示，不可能所有的獨立實驗室都出現(xiàn)細(xì)胞污染，“事實上，多位署名作者的實驗室在做重復(fù)實驗之前，都會首先檢測細(xì)胞，確保它們不受支原體的污染?！?/p>
?韓春雨原始論文中圖3C的結(jié)果示意圖，上圖顯示了為NgAgo設(shè)計的的ssDNA以及為Cas9設(shè)計的sgRNA在它們的目標(biāo)質(zhì)粒pEGFP-N1上的位置。下圖顯示了在western雜交實驗中HELA細(xì)胞中目標(biāo)質(zhì)粒pEGFP-N1的產(chǎn)物eGFP的表達(dá)水平，還標(biāo)注了這些實驗中針對該質(zhì)粒的NgAgo和對應(yīng)的ssDNA或者Cas9和對應(yīng)的sgRNA。最下方的圖顯示了eGFP和內(nèi)參基因actin條帶的灰度比值。來源：Gao, Feng, et al ，Nature biotechnology (2016)
文章還指出，他們在重復(fù)韓春雨論文中圖3c的結(jié)果時，確實在轉(zhuǎn)染NgAgo和靶向GFP（綠色熒光蛋白）后看到GFP表達(dá)下降，但是并無法通過測序證實這是DNA突變的結(jié)果?！昂芏嘁蛩囟伎梢杂绊懙紾FP的表達(dá)，比如NgAgo靶向DNA的能力，以及轉(zhuǎn)染造成的非特異性應(yīng)激（non-specific stress）等?！弊髡邆冊谖恼轮薪忉屨f。
此外，韓春雨曾在多次報告中稱NgAgo實驗需要“高超的實驗技巧”，但20位作者的質(zhì)疑文章反駁了這一說法——“無論是論文最初刊發(fā)的實驗流程還是在Addgene網(wǎng)站發(fā)布的最新信息，這些步驟似乎都不需要‘高超的實驗技巧’?！辈糠肿髡呱踔僚蓪W(xué)生到韓春雨的實驗室拜訪學(xué)習(xí)，但在此期間，他們都未獲允許操作哺乳動物基因組編輯的實驗。其結(jié)果就是，沒有一個學(xué)生得到證實韓春雨數(shù)據(jù)的信息。
在文章最后，作者們表示，希望原始論文的作者們能夠澄清有關(guān)NgAgo的疑點，提供所有的實驗細(xì)節(jié)以重復(fù)其最初的結(jié)果。
據(jù)文章的通訊作者之一、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員魏文勝介紹，他們曾在10月中旬將這篇文章投給最初發(fā)表NgAgo論文的《自然-生物技術(shù)》，但《自然-生物技術(shù)》在此之前已收到一篇類似的文章，20位科學(xué)家遂轉(zhuǎn)投《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》，文章得以快速評審并發(fā)表。
韓春雨最新回應(yīng)：
再次重復(fù)成功
此前，韓春雨曾向《知識分子》表示，科學(xué)的問題要通過科學(xué)的方法去解決，“第二篇文章（關(guān)于NgAgo的文章）出來之前，這種質(zhì)疑聲音始終都會在的，不可能通過幾次報道，就解決問題的?！?學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞研究》（Cell Research）常務(wù)副主編李黨生博士也曾向《知識分子》表示，科學(xué)上的爭議的最終解決只能靠科學(xué)共同體的進(jìn)一步驗證。
面對《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》在線發(fā)表的針對NgAgo可重復(fù)爭議的文章，韓春雨在11月16日下午回應(yīng)《知識分子》稱，（質(zhì)疑）文章的具體內(nèi)容他還沒有看，但他的實驗室已經(jīng)再次重復(fù)實驗并成功，只是“細(xì)胞需要處理才能做”。然而，韓春雨拒絕透露處理細(xì)胞的詳情，稱“這個處理還沒有完善，如果要發(fā)文章，做出回應(yīng)（correspondence），還需要把這個東西進(jìn)一步明確”。
韓春雨說，他還找了兩家實驗室，按照他確定的方法能做出來。但是他不愿意透露這兩個實驗室的名字。
懸疑：
“誰來調(diào)查這件事情？”
在學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表針對已有研究工作的質(zhì)疑是解決學(xué)術(shù)爭議的重要一步，但是有關(guān)韓春雨實驗是否可以重復(fù)，當(dāng)前出現(xiàn)了尖銳對立的兩種觀點一直無法得到澄清?！叭绻荒苤貜?fù)，這究竟是一種誠實的錯誤，還是一種學(xué)術(shù)不端行為，現(xiàn)在依然不清楚”，中科院科技政策研究所研究員李真真對《知識分子》表示，“誰來調(diào)查這件事情？這么巨大爭議的問題現(xiàn)在沒人管，說明我們國家的科學(xué)共同體應(yīng)對此類問題還很不成熟?！?/p>
20位署名作者名單
Shawn Burgess，美國國立衛(wèi)生研究院人類基因組研究所資深研究員；
程臨釗，約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授；
谷峰，溫州醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院研究員；
黃軍就，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授；
黃志偉，哈爾濱工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院教授；
林碩，加州大學(xué)洛杉磯分校分子、細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)系教授；
李勁松，中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所研究員；
李偉，中科院北京動物所研究員；
秦偉，北京大學(xué)深圳研究院教授；
孫育杰，北京大學(xué)生物動態(tài)光學(xué)成像中心研究員；
松陽洲，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授；
魏文勝，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、生物動態(tài)光學(xué)成像中心研究員；
吳強，上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院教授；
王皓毅，中科院北京動物研究所研究員；
王曉群，中科院生物物理研究所研究員；
熊敬維，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所研究員；
席建忠，北京大學(xué)工學(xué)院研究員；
楊輝，中科院上海神經(jīng)生物學(xué)研究所研究員；
周斌，中科院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所研究員；
張博，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授。
致謝：王承志對本文亦有貢獻(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：
1.Burgess, S., Cheng, L., Gu, F. et al. Protein Cell (2016). doi:10.1007/s13238-016-0343-9
2.Gao, Feng, et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute." Nature Biotechnology (2016).
