《自然》刊文：當轉基因猴“患”上自閉癥
“患”上自閉癥的MeCP2轉基因猴
導語：
自閉癥患者在我國大概有上百萬甚至數(shù)百萬之多，然而治療這類疾病，目前沒有有效的藥物。建立自閉癥的非人靈長類動物模型研究自閉癥的機理以及潛在的藥物靶點，顯然非常重要。
2016年1月26日，中科院上海生命科學研究院神經科學研究所仇子龍研究組與該研究所蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊在《自然》雜志發(fā)表論文，報道了他們成功構建攜帶人類自閉癥基因MeCP2突變的轉基因猴，并且通過分子遺傳學與行為學分析，發(fā)現(xiàn)MeCP2轉基因猴表現(xiàn)出類人類自閉癥的刻板行為與社交障礙等行為。
該研究首次建立了攜帶人類自閉癥基因的非人靈長類動物模型，為深入研究自閉癥的病理與探索可能的治療干預方法提供了重要基礎。
文 | 李霄、仇子龍（中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所）
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在普羅大眾的印象中，自閉癥像是一種性格標簽，可以不吝惜地貼在那些不善社交、少與別人交流、性情內向的人的身上。然而對于醫(yī)學和神經科學相關的專業(yè)人士而言，自閉癥卻并不是一張輕易就能貼的標簽。
圖1（A） 首次對自閉癥做出臨床定義的Kanner醫(yī)生。（B）自閉癥患者的臨床表型：社交缺陷、刻板行為、語言障礙等(參考文獻 Huguet et al.)
自閉癥的首次臨床定義是在20世紀40年代由美國醫(yī)生Kanner提出的（圖1A），經過幾十年的發(fā)展，醫(yī)學領域認為自閉癥（autism）是一類廣泛性的神經系統(tǒng)發(fā)育性疾病，包括：瑞特綜合癥（Rett syndrome）、阿斯伯格綜合癥（Asperger syndrome）、童年瓦解性障礙等病癥。
由于是發(fā)育性疾病，患者從嬰幼年便開始發(fā)病，主要的病因是會影響到大腦發(fā)育過程的一些基因發(fā)生突變。患者的臨床表現(xiàn)主要在：
1.如對父母不產生依戀，不能與同齡兒童建立伙伴關系等此類社會交往行為的障礙；
2.如無法用動作表達自己意愿，語言運用和理解能力缺失等此類交流性障礙；
3.如無法對玩具感興趣，重復蹦跳，重復機械性動作等此類興趣缺失及重復刻板性行為，另有少量病患出現(xiàn)癲癇、智力低下、個體發(fā)育遲緩等較嚴重病癥（圖1B）。
近幾十年來，隨著生命科學的日新月異，對于自閉癥的研究和理解也越來越深入，從早期的臨床病理層面，逐步深入到細胞以及分子的病理層面，使得人們對于自閉癥的發(fā)生、病程進展以及治療有了更全面和精細的了解。
目前的研究結果顯示：自閉癥并不是神經系統(tǒng)的嚴重的、器質性的損傷，而是與神經系統(tǒng)的發(fā)育過程密切相關，其中最重要的則是與神經突觸功能有關。
對于神經系統(tǒng)而言，神經元是此系統(tǒng)的核心，也是最基本的功能單位。神經元彼此之間相互連接才能順暢地傳遞神經信號，完成最基本的神經功能。而神經元彼此之間的連接樞紐則構成了大腦行使高級神經活動的基礎。神經元間相互連接的界面被稱為神經突觸，由此可以理解突觸對于神經系統(tǒng)的重要性。
有趣的是，神經元間的連接并不是靜態(tài)的，而是一直處于動態(tài)的變化當中，舊的不需要的突觸消失，新的突觸又形成，在這個此消彼長的過程中，消失與形成卻不是隨機而是處于精密的調控機制操縱之下發(fā)生的。那些與突觸這個微小卻又重要的結構以及調控這個結構消亡產生相關的生命源代碼——基因，毫無疑問，也與自閉癥有著密切而重要的聯(lián)系（圖2）。
圖2 與自閉癥相關的突觸功能和調控基因(參考文獻 Delorme et al.)
在這些相關的基因中，一個名叫甲基化CpG島結合蛋白2（MeCP2）的基因，以其有趣的特征吸引了研究者們的注意。
MeCP2基因編碼一種甲基化DNA結合蛋白，它本身雖然不直接參與到神經突觸的結構和功能中，但卻可以通過結合DNA的甲基化CpG島或是“招募”轉錄因子來操縱與神經突觸功能及調控相關基因的表達，從而間接地對神經突觸功能產生重要影響。當MeCP2基因因突變或者缺失喪失功能時，可導致瑞特綜合癥；而當MeCP2的基因拷貝數(shù)異常增多時，卻又會導致男性患者具有嚴重自閉癥癥狀的疾病，被命名為MeCP2倍增綜合癥（MeCP2 duplication syndrome）。
由此可見，體內MeCP2這個基因的表達量如同一座天平，必須保持著精妙的平衡，無論過多或者過少，都會導致神經突觸及神經系統(tǒng)功能的異常，從而導致自閉癥（圖3）。
圖3 MeCP2表達量必須維持精妙的平衡以保證神經系統(tǒng)的功能正常
然而，僅僅知道了遺傳背景和分子機制，對于治療自閉癥還是遠遠不夠的。如何為發(fā)病過程提供一個觀察窗口以及為治療方案提供一個可供測試的動物模型也是非常重要的，近年來基因編輯技術及模式動物的發(fā)展對此提供了非常有利的條件。
現(xiàn)有的研究結果已經報道了MeCP2基因敲除的小鼠模型，該模型的確展現(xiàn)出與瑞特綜合癥非常相似的表型，為瑞特綜合癥的觀察和治療提供了便利；同時，MeCP2轉基因的小鼠模型也同樣已得到建立，該模型也展現(xiàn)出明顯的社交功能障礙。但自閉癥畢竟涉及多種復雜的高級神經活動，如果要為臨床研究與治療提供更為有力的支持，小鼠已顯得捉襟見肘，更高級的動物模型和更復雜的神經系統(tǒng)是非常必要的。
為了解決這個問題，中科院上海生科院神經所的仇子龍研究組和蘇州靈長類平臺孫強博士通過使用慢病毒載體侵染帶入外源基因的方法（圖4A），成功建立了在神經系統(tǒng)中特異性過表達MeCP2基因的轉基因食蟹猴模型（圖4B）。通過分子生物學和生物化學方法的鑒定，外源的MeCP2基因有效地插入了食蟹猴的基因組之中（圖4C），并且能夠只在神經系統(tǒng)中進行表達。
圖4 （A）病毒載體中外源轉基因片段的設計方案。（B）在母親照看下的新生F0代轉基因食蟹猴。（C）深度測序得到的轉基因插入位點的全基因組Mapping。（D）行動路線追蹤結果示意及重復路徑時間結果統(tǒng)計。（E）社群內社交行為檢測的行為學范式。（F）F0代配對社交行為測試的結果。（G）新生的F1代轉基因食蟹猴。（H）F1代配對社交行為測試結果。
遺傳學層面的操作已經成功，種子既已種下，會在食蟹猴這一非人靈長類動物的土壤中結出怎樣的果實呢？轉基因食蟹猴相對于野生型的對照食蟹猴又會展現(xiàn)出怎樣的不同呢？帶著這樣的疑問，研究人員們對此模型進行了長期的體征觀察和大量的行為學測試。
在體征觀察與記錄中，MeCP2轉基因食蟹猴表現(xiàn)出明顯的體重發(fā)育遲緩以及血漿中脂肪酸代謝的異常，這兩種表型也見于一些自閉癥患者的臨床表現(xiàn)的報道中。而在行為方面，對食蟹猴進行行動路線追蹤的結果顯示，轉基因食蟹猴會花費更多的時間在一種刻板的重復性路徑行進上（圖4D）。而當人為的給予轉基因食蟹猴威脅性刺激時，相對于野生型食蟹猴，該型食蟹猴會表現(xiàn)出更強烈的焦慮情緒與敵意。在最為重要的社交行為及能力方面，研究人員發(fā)現(xiàn)，無論是在社群內的社交行為（圖4E）還是與另一只配對的社交行為，轉基因食蟹猴的社交頻率統(tǒng)計結果均顯著低于野生型對照（圖4F），該結果對于評估MeCP2轉基因食蟹猴的類自閉癥表型具有重要的意義。
在此之后，研究人員又通過威斯康星認知行為測試對轉基因食蟹猴的學習能力進行了評估，在該項實驗中，轉基因食蟹猴并沒有表現(xiàn)出明顯的學習障礙，但卻出現(xiàn)了被認為是自閉癥表征的重復刻板行為。
MeCP2轉基因猴 F0代
在自閉癥研究中，遺傳是不得不考慮的一項重要因素。為了深入研究此問題，在研究人員的努力下，通過將轉基因食蟹猴的精巢組織移植至裸鼠皮下發(fā)育成熟，成功地在短期內得到了原代轉基因食蟹猴（F0）的子代猴（F1）（圖4G），經過遺傳學檢測，研究人員們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)0代轉基因食蟹猴基因組中的外源插入片段的位點，通過種系傳遞，遺傳至F1代子猴的基因組中，并且F1代子猴中位點的分布與F0代比較，呈現(xiàn)出典型的孟德爾分離現(xiàn)象。此結果顯示，F(xiàn)1子代猴從親代F0身上遺傳到了神經系統(tǒng)中特異性過表達MeCP2的特性，并且針對于F1的配對社交行為檢測結果也顯示，轉基因食蟹猴相較于野生型對照也展現(xiàn)出社交行為頻率的顯著下降（圖4H），該表型與F0親代猴以及自閉癥患者的臨床表型是相似的。
MeCP2轉基因猴 F1代
在此項研究中，仇子龍研究組與轉基因靈長類平臺成功建立了神經系統(tǒng)特異性表達MeCP2的轉基因食蟹猴模型，且該轉基因可以通過種系傳遞向子代進行遺傳。并且，在第一代與第二代轉基因猴中，MeCP2的異常表達都導致了轉基因食蟹猴出現(xiàn)明顯的類自閉癥行為，簡而言之，使猴子患上了自閉癥。
該項工作為觀察自閉癥的神經科學機理研究提供了一扇重要的窗口，并為之后進一步的研究自閉癥的干預方法提供了堅實的基礎，最終為自閉癥的臨床治療提供了良好的動物模型和試驗平臺。在接下來的工作中，研究者已經開展了對患有自閉癥的MeCP2轉基因猴進行詳細的腦成像研究，以期待用基因編輯的工具對這些攜帶自閉癥基因的轉基因猴進行基因治療，探索最終治愈自閉癥的途徑。
論文鏈接及參考文獻：
Liu Z, Li X, Sun Q, Qiu ZL, et al. Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature. 2016.
Huguet G, Ey E, Bourgeron T. The genetic landscapes of autism spectrum disorders. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2013;14:191-213.
Delorme R, Ey E, Toro R, Leboyer M, Gillberg C, Bourgeron T. Progress toward treatments for synaptic defects in autism. Nat Med. 2013 Jun;19(6):685-94.
本文原載上?！犊茖W》雜志2015年第6期，《知識分子》獲雜志及作者授權刊發(fā)。
