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一種比恐龍還古老的生物，幫助單堿基編輯擴(kuò)充了“武器庫(kù)”

2019/08/17
導(dǎo)讀
這種“史前”美味，給單堿基編輯器的優(yōu)化帶來(lái)了希望。


- 編者按 -
 
毫無(wú)疑問(wèn)，基因編輯是當(dāng)前最為火熱的一個(gè)研究領(lǐng)域。這篇文章解釋了時(shí)下最為歡迎的基因編輯工具 CRISPR 的工作機(jī)制，并解釋了單堿基編輯器的出現(xiàn)為何是基因編輯領(lǐng)域的一個(gè)突破。

而對(duì)于單堿基編輯器來(lái)說(shuō)，脫氨基酶決定其安全性和適用范圍。最近，仇子龍及其團(tuán)隊(duì)從一種比恐龍還要古老的寄生生物身上得到靈感，通過(guò)篩選多樣化的胞嘧啶脫氨基酶，構(gòu)建出一系列新的胞嘧啶堿基編輯器（CBEs），使其安全性和適用范圍得到了優(yōu)化和拓展。
 
撰文 | 程田林

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寫(xiě)在前面的話(huà)：DNA與基因


要了解基因編輯，需要對(duì)DNA與基因有充分的認(rèn)識(shí)。我們裝修自己的房屋，需要有設(shè)計(jì)圖紙，根據(jù)圖紙來(lái)按部就班地完成裝修。形象一點(diǎn)而言，DNA就是人體的設(shè)計(jì)圖紙，人體怎樣搭建，全靠DNA指引。繪制房屋設(shè)計(jì)圖紙，最基本的便是兩種線(xiàn)條：直線(xiàn)，弧線(xiàn)；人體的設(shè)計(jì)圖紙DNA最基本的則是四種堿基：ATGC。房屋設(shè)計(jì)圖紙中，通過(guò)線(xiàn)條的組合，我們可以描繪出書(shū)房、廚房、臥室、餐廳等等；通過(guò)堿基的組合，我們可以設(shè)計(jì)出搭建人體所需要的各種蛋白質(zhì)及RNA，對(duì)應(yīng)著蛋白質(zhì)及RNA的堿基組合便是基因；基因描繪的，其實(shí)就是人體的“書(shū)房”、“廚房”、“臥室”、“餐廳”等等。房屋設(shè)計(jì)圖紙出錯(cuò)，我們可以通過(guò)橡皮或是修正液加以改正?；虺隽隋e(cuò)，我們?cè)撊绾胃恼?？基因編輯工具就是?fù)責(zé)修正基因的工具。為了改正房屋設(shè)計(jì)圖紙，我們希望能有更好用的橡皮或修正液，最好能安全無(wú)痕；我們不斷地開(kāi)發(fā)優(yōu)化基因編輯工具，當(dāng)然也是希望能安全無(wú)痕的改正出錯(cuò)的基因。
 


一、CRISPR-Cas9系統(tǒng)的誕生


生物學(xué)研究可以看做是 “尋寶” 之旅，每名研究者都在尋找自己眼中的 “寶藏”。很多時(shí)候，預(yù)期的 “寶藏” 未能尋到，卻在不經(jīng)意間開(kāi)啟了 “藏寶洞”。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)就是這樣的意外。
 
1987年，大阪大學(xué)的 Yoshizumi Ishino 及其同事正關(guān)注于大腸桿菌的iap基因，他們已經(jīng)完成了該基因的測(cè)序工作。按照莫諾&雅各布的乳糖操縱子理論，基因的上下游很可能有調(diào)控元件的存在（圖1A）。于是，Yoshizumi Ishino 也就順理成章地對(duì)iap基因的上下游序列進(jìn)行了測(cè)序。只是，他們沒(méi)有尋找到預(yù)期的 “寶藏”——調(diào)控元件，而是發(fā)現(xiàn)了無(wú)法破解的密碼——五段重復(fù)的DNA序列。想象一下跨欄比賽的欄桿，研究者發(fā)現(xiàn)了五個(gè)欄桿（重復(fù)的DNA序列），欄桿之間是長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段（圖1B）。這種特征的序列是前無(wú)古人的，研究者很懵。當(dāng)然，他們還是寫(xiě)了文章，描述了這一奇怪的發(fā)現(xiàn)，但沒(méi)人知道這意味著什么 [1]。

 圖1. 乳糖操縱子基本結(jié)構(gòu)及CRISPR-Cas位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)歷程
 
到了二十世紀(jì)九十年代，測(cè)序技術(shù)不斷進(jìn)步，研究者們?cè)谖⑸锏幕蚪M中不斷發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的特征序列，當(dāng)然，依舊無(wú)人知曉這些序列的秘密。2002年，烏得勒支大學(xué)的 Ruud Jansen 團(tuán)隊(duì)決定重新分析這類(lèi)序列，看看是否能“挖寶”。
 
首先，這類(lèi)序列有了名字，叫做 “規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)”（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。CRISPR 的名號(hào)自此而始。他們還發(fā)現(xiàn)，CRISPR 序列可以轉(zhuǎn)錄成 RNA；而且序列附近似乎總是有類(lèi)似的基因相伴，于是這些基因就叫做Cas（CRISPR-associasted），Cas編碼的蛋白能切割 DNA（圖2）[2]。至此，CRISPR-Cas 系統(tǒng)成型，但它存在的意義依然是一片空白。
 
后來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)，CRISPR 序列跟某些噬菌體（這是一種感染細(xì)菌的病毒）基因組的部分序列很匹配。至此，細(xì)菌與噬菌體被聯(lián)系在了一起。此時(shí)，進(jìn)化生物學(xué)家 Eugene Koonin入場(chǎng)：他整合了關(guān)于 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的所有碎片化信息，指出，CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，是細(xì)菌對(duì)抗病毒的武器 [3]。
 
進(jìn)化生物學(xué)家做完預(yù)測(cè)就已經(jīng)完成任務(wù)。不過(guò)聽(tīng)者有意。微生物學(xué)家Rodolphe Barrangou 很喜歡這個(gè)理論，就去設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn) Koonin 的理論竟然是對(duì)的！也就是說(shuō)，被噬菌體感染后，細(xì)菌會(huì)通過(guò) CRISPR-Cas 系統(tǒng)切割噬菌體的基因組以保留證據(jù)；如果細(xì)菌能僥幸存活，面對(duì)同樣的噬菌體感染時(shí)，它們就能利用已有的證據(jù)消滅噬菌體以保護(hù)自己 [4]。
 
此時(shí)，CRISPR-Cas 系統(tǒng)的功能基本確定，但具體的細(xì)節(jié)依然有待研究。此時(shí)關(guān)鍵人物 Jennifer Doudna 與 Emmanuelle Charpentier 入場(chǎng)，正是她們的研究讓我們明白了 CRISPR-Cas 系統(tǒng)抵御外敵入侵的詳細(xì)機(jī)制，也讓基因編輯成為了可能。具體而言，這一機(jī)制可分為三步：
 
第一步是Cas蛋白復(fù)合物對(duì)外敵DNA的識(shí)別，保留證據(jù)（長(zhǎng)度為30-50bp的外敵DNA（被稱(chēng)作原型間隔序列））在自己的基因組（CRISPR位點(diǎn)）中（圖2，步驟1-2）。
 
第二步是 CRISPR 位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，最終形成兩條短鏈的 crRNAs（CRISPR來(lái)源的RNAs）和 tracerRNA（反式作用的crRNA）。其中 crRNAs 負(fù)責(zé)攜帶外敵信息，這是 CRISPR-Cas 系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)抗外敵入侵的基礎(chǔ)（圖2，步驟3）。
 
第三步是清除入侵的外敵 DNA。如果 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是武器，前兩步好比武器零件的制造，這一步就是武器的組裝：Cas9 蛋白、crRNA 和 tracerRNA 組成整體，其中 crRNA 好比瞄準(zhǔn)鏡，精確制導(dǎo)，Cas9 蛋白則像一把剪刀，去剪斷被鎖定的外敵 DNA（圖2，步驟4-5）。[5-6]
 
圖2 CRISPR-Cas抗病毒的基本原理（來(lái)自www.scienceinschool.org）。
 
大家都欣喜若狂！CRISPR-Cas 系統(tǒng)能清除外敵 DNA，是因?yàn)?crRNA 的序列與外敵 DNA 序列匹配。如果改變瞄準(zhǔn)鏡 crRNA 的序列，使之匹配其它物種的基因組序列，豈不是指哪打哪？
 
經(jīng)過(guò)不斷的優(yōu)化，指哪打哪的 CRISPR-Cas9 武器真的誕生了（圖3）[7]。
 
圖3 CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)的基本原理（J.D.Sander etal. 2014）
 


二、DNA單堿基編輯器的誕生


最開(kāi)始，CRISPR-Cas9 是剪刀，剪斷 crRNA 瞄準(zhǔn)的基因組位點(diǎn)。但是，兩把剪刀不嫌多，有三把更好。研究者們各顯神通，“魔改” 系統(tǒng)，將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)打造成了十八般武器：比如，剪刀太鋒利，就把剪刀磨鈍，只讓 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)負(fù)責(zé)定位或是在基因組上留下缺口，而不要完全切斷基因組；要想調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，就給鈍剪刀加上轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器；要想精修基因組，就給鈍剪刀加上各樣的修剪器。
 
我們都知道，DNA 序列是由四種不同的堿基組成，通過(guò)不同的排布，便可以?xún)?chǔ)藏豐富的信息。如果有特定的堿基改變，其儲(chǔ)藏的信息也會(huì)發(fā)生改變。那么，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)能否被改造成精準(zhǔn)改變特定堿基的武器？細(xì)胞內(nèi)有一類(lèi)酶，叫做堿基脫氨基酶，其中有兩種，一是胞嘧啶脫氨基酶，它可以讓胞嘧啶（C）變成尿嘧啶（U），而U在基因組中會(huì)被替換成胸腺嘧啶（T），從而能實(shí)現(xiàn)堿基的改變（C->T）（圖4A）；另一類(lèi)是腺嘌呤脫氨基酶，它可以讓腺嘌呤（A）變成次黃嘌呤（I），在基因組中I發(fā)揮鳥(niǎo)嘌呤（G）的功能，從而能實(shí)現(xiàn)堿基的改變（A->G）（圖4B）。
 
而將磨鈍的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)與脫氨基酶組合，研究者獲得了可實(shí)現(xiàn)堿基轉(zhuǎn)換的新武器——單堿基編輯器（Baseeditors，BEs）。介導(dǎo) C->T 改變的被稱(chēng)為胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）[8]，而介導(dǎo)A->G改變的被稱(chēng)為腺嘌呤堿基編輯器（ABEs）[9]。不過(guò)單堿基編輯器有兩大問(wèn)題，一是瞄準(zhǔn)鏡的范圍小，有的位置瞄不到；二是有脫靶，不小心會(huì)改變其它位置的堿基，從而引發(fā)安全風(fēng)險(xiǎn) [10]。
 
圖4 脫氨基酶與堿基轉(zhuǎn)換（改自H.A.Rees etal. 2018）
 


三、單堿基編輯器的深度演化


要改造優(yōu)化單堿基編輯器，更換不同的脫氨基酶是可行的策咯。CBE 系統(tǒng)中常用的脫氨基酶分別來(lái)自大鼠的 APOBEC1，人的 AID1 和七鰓鰻的 PmCDA1，它們有著相似的編輯范圍。自然界是否還有另類(lèi)的脫氨基酶存在？這需要深入挖掘。
 
在挖礦一般的查找文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫(kù)后，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心研究員仇子龍及其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，七鰓鰻中有著相當(dāng)多樣的胞嘧啶脫氨基酶（圖5）[11]，值得深入探索。

圖5 三種七鰓鰻中的胞嘧啶脫氨基酶及大鼠APOBEC1和人源AID的序列比對(duì)（Cheng et al.2019）
 
七鰓鰻，是一種比恐龍還要古老的寄生生物，它們?cè)诘厍蛏系纳鏁r(shí)間已經(jīng)超過(guò)3.6億年。作為寄生生物，七鰓鰻有吸血狂魔的惡名（圖6）。在美食家眼中，七鰓鰻卻又享有盛名：它的美味曾經(jīng)讓英王亨利一世無(wú)法自拔，并最終吃的太多，腹脹而死。

圖6 七鰓鰻的卡通圖及實(shí)物圖
 
這樣一種 “史前” 美味，給單堿基編輯器的優(yōu)化帶來(lái)了希望。
 
七鰓鰻會(huì)表達(dá)多種不同的胞嘧啶脫氨基酶，而且不同種的七鰓鰻所含的酶功能各有差異 [11]。這些多樣化的酶與 CRISPR/Cas 系統(tǒng)組合后極大的拓展了 CBEs 的活性范圍，這讓瞄準(zhǔn)范圍更廣，極大地豐富了單堿基編輯的工具箱。如同樂(lè)高積木一樣，通過(guò)不同的組合策略，我們獲得了一系列的 CBEs，它們有著不同特色的瞄準(zhǔn)鏡，使得活性范圍更加多樣化，從而有著不同的適用場(chǎng)景，這讓工具箱中的CBE 工具更加豐富，在使用上也有了更大的選擇余地（圖7）[12]。此外，新添加的 CBE 工具在安全性上也有了明顯的改善，這為單堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用提供了更多選擇，新的胞苷脫氨酶也為未來(lái)單堿基編輯工具的開(kāi)發(fā)和改善提供了基礎(chǔ)。
 
圖7：CBE系統(tǒng)的分類(lèi)（Cheng et al. 2019）CBE 系統(tǒng)的活性窗口定義為 sgRNA 中編輯效率>40%的C位點(diǎn)。（a）前置型CBE（FSCBEs），其活性窗口主要位于sgRNA靶位點(diǎn)的前端（PAM位點(diǎn)看作最末端）。（b）后置型 CBE（BSCBEs），活性窗口主要位于 sgRNA 靶位點(diǎn)的后端。（c）廣譜型 CBE（BRCBEs），活性窗口橫跨 sgRNA 靶位點(diǎn)的前后端。
 
單堿基編輯技術(shù)有著相當(dāng)廣泛的應(yīng)用（圖8），它在動(dòng)物模型的構(gòu)建、疾病治療、作物育種以及點(diǎn)突變篩選等等多個(gè)方面都極具潛力 [13]。開(kāi)發(fā)安全性高、適用范圍廣的單堿基編輯工具將有助于其潛力的兌現(xiàn)，從而更好的服務(wù)于生物醫(yī)學(xué)研究。新的 CBE 工具在安全性和適用范圍上均取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，為單堿基編輯技術(shù)的進(jìn)步做出了貢獻(xiàn)。
 
圖8 單堿基編輯技術(shù)的應(yīng)用前景 （改自K.A.Molla et al. 2019）

作者簡(jiǎn)介

程田林博士，助理研究員，中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心，中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所

 
參考文獻(xiàn)：
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制版編輯 | 皮皮魚(yú)


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