基因編輯先驅(qū)發(fā)現(xiàn)新的CRISPR/Cas系統(tǒng)
Jennifer Doudna，圖片來(lái)源：Doudna Lab
撰文 | 郝春暉
責(zé)編 | 葉水送
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有著“基因魔剪”之稱的CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借其優(yōu)良的可操作性以及精準(zhǔn)的靶向定位能力等特點(diǎn)，迅速取代了鋅指核酸酶（ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）等工具，成為了全世界實(shí)驗(yàn)室主流的基因編輯工具。
在CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)展的歷史上，加州大學(xué)伯克利分校的分子生物學(xué)家Jennifer Doudna貢獻(xiàn)卓著，她不僅是最早發(fā)展CRISPR/Cas技術(shù)的科學(xué)家之一，其團(tuán)隊(duì)直至今日仍在努力完善這項(xiàng)技術(shù)。最近，Doudna團(tuán)隊(duì)在基因編輯領(lǐng)域有了新的進(jìn)展。
2月4日，Doudna在《自然》雜志發(fā)表的論文，圖片來(lái)源Nature
2019年2月4日，Doudna團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志在線發(fā)表論文，揭示了名為CRISPR-CasX的新系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的潛在機(jī)制，這勢(shì)必會(huì)掀起基因編輯領(lǐng)域新的技術(shù)浪潮。
CRISPR/Cas系統(tǒng)原本是一種廣泛存在于細(xì)菌和古菌中的RNA介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。
其中CRISPR相當(dāng)于“標(biāo)記筆”，可被用來(lái)識(shí)別二次入侵的外源DNA，而Cas（CRISPR associated protein）則是一種可以切割DNA的核酸內(nèi)切酶，是“基因魔剪”中的“剪刀”，利用CRISPR識(shí)別特定的DNA片段并對(duì)其進(jìn)行切割。目前最常用的Cas酶是Cas9和Cas12a (Cpf1)，盡管它們效率很高，但是依然存在一些問(wèn)題：
1. 它們太大了（Cas9：1369個(gè)氨基酸、Cas12a：1353個(gè)氨基酸），因此將它們轉(zhuǎn)入細(xì)胞中比較困難；
2. Cas酶需要先識(shí)別入侵者的“身份證”（protospacer adjacent motif，PAM），如Cas9可以識(shí)別出的PAM序列是NGG，這就在一定程度上限制了Cas酶進(jìn)行基因編輯的范圍。
因此，人們一直在尋找更多的、體積較小的Cas酶。前不久，CRISPR/Cas系統(tǒng)的主要發(fā)明人之一，來(lái)自MIT的張峰及其團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種可以在哺乳動(dòng)物和人體中進(jìn)行有效的基因編輯的新系統(tǒng)CRISPR-Cas12b。
此項(xiàng)成果建立在Doudna團(tuán)隊(duì)2016發(fā)表在Nature的工作基礎(chǔ)之上。彼時(shí)，她們與同樣來(lái)自加州大學(xué)伯克利分校的微生物學(xué)家Jillian F. Banfield合作，利用宏基因組技術(shù)從地下水、沉積物、礦山酸性廢水、土壤、嬰兒腸道等環(huán)境中尋找CRISPR-Cas系統(tǒng)。這些環(huán)境中存在大量無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)的細(xì)菌，但是宏基因組技術(shù)可幫助科學(xué)家無(wú)需培養(yǎng)就能獲取細(xì)菌的必要信息。通過(guò)生物信息學(xué)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)了兩種新的CRISPR-Cas系統(tǒng)——CRISPR-CasX和CRISPR-CasY，其中CasX僅有986個(gè)氨基酸大小。
研究者利用宏基因組技術(shù)尋找到的新的Cas酶，圖片來(lái)源: Nature
此次，她們先利用生物化學(xué)手段探究了CasX如何在體外切割雙鏈DNA (dsDNA)。研究發(fā)現(xiàn)CasX酶必須在sgRNA（single-guide RNA）的引導(dǎo)下才能進(jìn)入細(xì)菌對(duì)靶向基因組進(jìn)行剪切, 二者合力能夠切割帶有與長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸的指導(dǎo)RNA區(qū)段互補(bǔ)的序列、并且與序列為TTCN的PAM區(qū)域相鄰的dsDNA。
通過(guò)繪制DNA的靶鏈（Target strand）和非靶鏈（Non-target strand）的切割位點(diǎn)的圖譜，研究人員發(fā)現(xiàn)CasX會(huì)產(chǎn)生具有約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的交錯(cuò)雙鏈斷裂，這是因?yàn)镃asX是在非靶鏈上的PAM區(qū)域之后12-14個(gè)核苷酸處和靶鏈上的PAM區(qū)域之后22-25個(gè)核苷酸處進(jìn)行切割。
CasX在體外切割dsDNA的模式，圖片來(lái)源：Nature
進(jìn)一步地研究，科研人員發(fā)現(xiàn)CasX可以在大腸桿菌與人類細(xì)胞中有效地沉默或編輯基因。
CasX的分子結(jié)構(gòu)，圖片來(lái)源：Nature
這些發(fā)現(xiàn)證明CasX系統(tǒng)可被發(fā)展為有效的基因編輯工具。而CasX的小尺寸（<1,000個(gè)氨基酸）的特性則可使該系統(tǒng)相比于其他Cas系統(tǒng)更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，CasX系統(tǒng)的切割模式以及其源自非病原微生物的特性，保證了該系統(tǒng)在基因治療領(lǐng)域同樣具有光明的前景。
